發(fā)布時間：2020-11-02 06:31

　　 神經(jīng)肽是昆蟲體內(nèi)最多樣化的一類信號分子,作為神經(jīng)激素和神經(jīng)調(diào)質(zhì)全面調(diào)控昆蟲的生理和行為。絕大多數(shù)神經(jīng)肽通過與細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合并啟動下游信號通路以行使其功能。神經(jīng)肽GPCR作為新型可替代殺蟲劑的靶標(biāo),為害蟲防治提供了新的可能途徑。而實現(xiàn)這一目標(biāo)的前提是對昆蟲神經(jīng)肽系統(tǒng)的深入研究和理解。取食是對昆蟲個體生存和種群存續(xù)具有重要意義的行為,果蠅中已經(jīng)證實神經(jīng)肽F(Neuropeptide F,NPF)信號系統(tǒng)對調(diào)控該行為至關(guān)重要。然而該信號系統(tǒng)在蚜蟲中的功能卻知之甚少。為了加深對蚜蟲神經(jīng)肽系統(tǒng)的了解,本文選擇了農(nóng)業(yè)害蟲花生蚜Aphis craccivora作為蚜蟲的代表,利用RNA-seq技術(shù)和tBlastn程序?qū)赡芫幋a神經(jīng)肽前體及其GPCR的基因進(jìn)行了全面挖掘。在此基礎(chǔ)上對假定神經(jīng)肽前體的結(jié)構(gòu)和翻譯后加工方式進(jìn)行了分析和預(yù)測,并對神經(jīng)肽GPCR進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析及配體預(yù)測。同時,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)明確了候選基因在花生蚜不同發(fā)育階段的表達(dá)譜。本文進(jìn)一步分析了NPF信號系統(tǒng)在蚜蟲中的生物學(xué)功能;鑒于該信號系統(tǒng)在蚜蟲中高度保守,從易操作性考慮選擇了體型更大的豌豆蚜Acyrthosiphon pisum(孤雌生殖無翅蚜)作為研究對象。利用qRT-PCR分析了NPF基因及其受體基因NPFR的時空表達(dá)模式及對取食和營養(yǎng)狀態(tài)的響應(yīng)。并利用RNAi及刺吸電位圖譜(EPG)技術(shù)來探究NPF信號系統(tǒng)和蚜蟲刺探取食行為之間的關(guān)系。最后,通過同源建模和分子對接技術(shù),分析了豌豆蚜NPF與其受體NPFR可能的結(jié)合位點。本文主要研究結(jié)果如下:從花生蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定得到抑咽側(cè)體激素(allatostatin,Ast)、抑肌肽(myosuppressin,MS)、胰島素樣肽(insulin-like peptide,ILP)、蜚蠊激肽(leucokinin,LK)、速激肽(tachykinin,TK)、短神經(jīng)肽F(short neuropeptide F,sNPF)等32個神經(jīng)肽家族共計40條神經(jīng)肽前體的編碼基因,與已報道其它昆蟲的神經(jīng)肽基因數(shù)目基本相當(dāng)。在此基礎(chǔ)上通過軟件分析同時參考已報道同源神經(jīng)肽,對候選神經(jīng)肽前體的信號肽序列以及酰胺化、焦磷酸化等修飾位點進(jìn)行了分析,共預(yù)測得到164個成熟肽,其中可能具有生物學(xué)活性的成熟神經(jīng)肽超過60個。通過表達(dá)譜分析明確了各神經(jīng)肽基因在不同齡期和不同翅型中的表達(dá)模式,重點關(guān)注了與昆蟲取食調(diào)控相關(guān)的幾種神經(jīng)肽基因:成蚜期和若蚜期呈現(xiàn)明顯差異表達(dá)的有LK、NPF和sNPF,在無翅蚜和有翅蚜中呈現(xiàn)差異表達(dá)的有AstA、AstB、AstCC、LK、MS、NPF和sNPF。共鑒定獲得46條神經(jīng)肽GPCR的編碼基因,其中40條編碼A家族GPCR,包括21種神經(jīng)肽的受體,以及7條孤兒受體;6條編碼B家族GPCR,包括利尿激素31(diuretic hormone 31,DH31)受體、DH44受體和色素分散因子(pigment-dispersing factor,PDF)受體。與果蠅等完全變態(tài)昆蟲相比,花生蚜中沒有發(fā)現(xiàn)硫激肽(sulfakinin,SK)、黑化誘導(dǎo)激素(corazonin,Crz)、精氨酸加壓素樣肽(arginine-vasopressin-like peptide,AVLP)和trissin肽以及這些神經(jīng)肽相應(yīng)受體的編碼基因,推測花生蚜中很可能缺失上述神經(jīng)肽通路,這一特點與豌豆蚜一致。此外,確定了花生蚜中各神經(jīng)肽GPCR基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜。與取食調(diào)控有關(guān)的幾種受體基因,在無翅蚜或有翅蚜的不同齡期都呈明顯差異表達(dá);在同一齡期的不同翅型中也呈差異表達(dá)。NPF基因主要在無翅成蚜頭部表達(dá),但在腸道中未檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄;而NPFR基因主要在蚜蟲腸道和頭部表達(dá)且前者表達(dá)量大約是后者的2倍。兩個基因的表達(dá)水平還隨發(fā)育階段而不同,暗示該信號系統(tǒng)與蚜蟲發(fā)育相關(guān)。取食和營養(yǎng)狀況對NPF表達(dá)水平有明顯影響,而對其受體基因基本無影響;饑餓導(dǎo)致NPF轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),而恢復(fù)飼喂導(dǎo)致該基因表達(dá)量回調(diào)至最初水平。注射dsRNA能有效沉默無翅成蚜的NPF基因(干擾效率達(dá)到50%),但對NPFR效果甚微。NPF沉默后無翅成蚜的蜜露分泌量顯著減少,表明取食量的下降。進(jìn)一步利用EPG技術(shù)檢測干擾組蚜蟲對蠶豆苗刺探取食行為的改變,發(fā)現(xiàn)韌皮部取食的總時間縮短是取食量減少的直接原因。韌皮部取食的減少和第一次韌皮部取食發(fā)生延后,表明蚜蟲對韌皮部汁液的偏好性下降;首次口針刺探行為的延后以及刺探取食的總時間縮短也同樣表明干擾組蚜蟲的取食意愿減弱。同時發(fā)現(xiàn),NPF沉默會導(dǎo)致成蚜繁殖力下降,但不會降低其存活率。此外,利用同源建模技術(shù)分別構(gòu)建了豌豆蚜NPFR受體蛋白及其內(nèi)源性多肽配體NPF的三維結(jié)構(gòu)模型,在此基礎(chǔ)上利用分子對接技術(shù)可視化兩者之間的相互作用方式,結(jié)果顯示NPF與NPFR的主要結(jié)合位點可能是Phe45-Leu5、Arg44-Asp6、Ser41-Phe194和His1-Thr295之間形成的4個氫鍵,這為設(shè)計靶向蚜蟲NPF信號系統(tǒng)的激動劑或拮抗劑提供了參考信息。綜上所述,RNA-seq可以作為挖掘昆蟲神經(jīng)肽及其GPCR基因的有效技術(shù)手段�；ㄉ辽窠�(jīng)肽及其受體的鑒定工作為下一步這些神經(jīng)通路的功能分析奠定了堅實的基礎(chǔ),而且對開發(fā)蚜蟲防治的新靶標(biāo)具有重要意義。同時,發(fā)現(xiàn)NPF信號系統(tǒng)參與到了蚜蟲取食行為的調(diào)節(jié)中,起正向調(diào)控作用。本研究首次揭示了NPF信號系統(tǒng)與蚜蟲取食行為之間的關(guān)系。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S433.3
【部分圖文】：

相關(guān)或不相關(guān)的肽。神經(jīng)肽作為信號分子，要通過與細(xì)胞表面特定的受體分子相結(jié)合，從而激活胞內(nèi)第二信使以及下游一系列的級聯(lián)反應(yīng)來行使生物學(xué)功能。除少數(shù)神經(jīng)肽外，大多數(shù)神經(jīng)肽的受體是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCR）（圖1-1）。一種神經(jīng)肽可能存在不止一種GPCR，這種現(xiàn)象在脊椎動物中尤為普遍（N ssel &larhammar 2013）。一般情況下神經(jīng)肽及其GPCR非常保守，一些神經(jīng)肽信號系統(tǒng)在脊椎動物和無脊椎動物中具有一定的結(jié)構(gòu)和功能同源性，保留了在發(fā)育、生長、內(nèi)穩(wěn)態(tài)或行為方面的基本作用，例如胰島素樣肽（insulin-like peptide, ILP）、催產(chǎn)素/血管加壓素（oxytocin/vasopressin）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y, NPY）以及速激肽（tachykinin,TK）等（N ssel and Wegener 2011）。圖 1-1 神?

的分布模式（引自 N ssel et al. 2019）。藍(lán)色表示的肽也由支配腸道的的多肽尚未在成蟲中被證實。一些果蠅神經(jīng)肽由于缺乏明確的信息并opeptide distribution patterns in Drosophila. The peptides indicated in blfferent CNS neurons that innervate the intestine. Peptides in brackets havult structures. Note that some Drosophila peptides are missing in this figof clear information.的起源種類繁多，有些昆蟲神經(jīng)肽顯示出與脊椎動物神經(jīng)肽高度K。其它神經(jīng)肽如Proc或EH則是節(jié)肢動物所獨有的（N sse少有 30 個神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的進(jìn)化起源已被追溯到原口動物lphick et al. 2018）。神經(jīng)肽存在于水螅、海蜇、珊瑚和�？爬系木哂猩窠�(jīng)系統(tǒng)的動物，因此神經(jīng)肽的起源可以追溯水母（Ctenophora）和扁盤動物中也發(fā)現(xiàn)存在神經(jīng)肽。根據(jù)這兩個類群比刺胞動物更古老。扁盤動物非常簡單，沒有肉和真正的消化道，但他們可以協(xié)調(diào)不同細(xì)胞來完成移動

-1 花生蚜各齡期。（A）二齡若蚜；（B）三齡無翅若蚜；（C）三齡有翅若蚜；（D）四齡無翅若蚜；（E）四齡有翅若蚜；（F）無翅成蚜與一齡若蚜；（G）有翅成蚜。. 2-1 Aphis craccivora at different development stages. (A) The 2nd instar nymph; (B) The 3rd instarless nymph; (C) The 3rd instar winged nymph; (D) The 4th instar wingless nymph; (E) The 4th instawinged nymphs; (F) The wingless adult and 1st instar nymph; (G) The winged adult..4 花生蚜樣品總 RNA 的提取按照 RNAisoPlus（Takara, Dalian）說明書分別對 2.2.3 節(jié)所述樣品進(jìn)行總 RNA 提具體步驟如下：（1）將組織樣品放入用液氮預(yù)冷的 1.5 ml 離心管中，離心管下部浸于液氮中，用棒充分研磨組織樣品；（2）加入適量 RNAiso Plus RNA 提取液，室溫靜置 5 min，放入提前預(yù)冷的 4℃離心機(jī)，12000 g 離心 5 min，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；（3）向上清液中加入 1/5 RNAiso Plus 體積量的氯仿，用手上下劇烈振蕩 15 s，無現(xiàn)象后室溫靜置 5 min，12000 g 4℃離心 5 min；（4）從離心機(jī)中小心取出離心管，小心轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中（切忌吸出白
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2866695