番茄褪綠病毒病(Tomato chlorosis virus,ToCV)是最近新發(fā)生的為害番茄生產(chǎn)最嚴重的病害之一,與其有關(guān)的研究很少,特別是關(guān)于褪綠病毒基因組結(jié)構(gòu)、被侵染植株褪綠病毒分子檢測、以及對防控褪綠病毒病暴發(fā)的有效措施等方面都還不清楚,迫切需要對ToCV病害進行精準鑒定和及時防治。本研究通過對選自文獻報道和重新設計的6對ToCV的RT-PCR檢測引物進行比較分析,篩選出靈敏度、穩(wěn)定性較高的引物組合,并對影響RT-PCR反應的條件進行優(yōu)化,確定最優(yōu)的反應條件。應用于咸陽興平市、咸陽涇陽縣、咸陽三原縣、渭南富平縣、寶雞太公鎮(zhèn)、咸陽武功鎮(zhèn)、咸陽五泉鎮(zhèn)、咸陽楊陵區(qū)、西安閻良區(qū)、西安高陵區(qū)、銅川野狐坡村、銅川水峪村等地溫室大棚內(nèi)的番茄植株ToCV的檢測,對ToCV與番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)復合侵染情況進行檢測,通過對ToCV基因組CP(Coat protein)和HSP70(Heat-shock protein 70 family)核苷酸和氨基酸序列進行測序,與Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已登錄的ToCV核苷酸和氨基酸序列進行一致性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,初步探究了陜西關(guān)中地區(qū)番茄種植產(chǎn)區(qū)ToCV類型及其與TYLCV復合侵染的發(fā)生及分布情況。此外,利用實時熒光定量PCR對ToCV的侵染進行檢測,精確判斷感病植株不同部位的病毒含量,為后續(xù)研究番茄褪綠病毒病的發(fā)病趨勢奠定研究基礎。另外,初步探究了環(huán)保酵素對番茄植株的生長和抗病性的影響,試圖探索一種預防ToCV發(fā)生的新栽培措施。主要結(jié)果如下:(1)引物To-CP-F/R-1和SDLC-HSP-F/R的靈敏度和特異性最好。引物To-CP-F/R-1擴增最適反應條件為,退火溫度在48.0~64.0℃之間,引物濃度區(qū)間為4~10μM。引物SDLC-HSP-F/R擴增最適退火溫度在40.9~64.3℃范圍內(nèi),最適引物濃度為4~10μM。(2)陜西關(guān)中地區(qū)番茄產(chǎn)區(qū)ToCV檢出率為40.94%。對獲得的分離物核苷酸序列與已登錄的分離物核苷酸序列進行比對,除與臺灣和廣東分離物的核苷酸序列一致性較低外,與其他地區(qū)分離物核苷酸序列一致性在96%以上。并對已獲得分離物和Genbank中已登錄分離物的核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果表明本研究所得分離物均聚類在同一分組上,除與臺灣及廣東的距離較遠外,與國內(nèi)分離物均較近�？赏茢鄧鴥�(nèi)ToCV具有共同的傳播來源。與美國的親緣關(guān)系最近,西班牙的親緣關(guān)系最遠。(3)進行ToCV檢測的同時進行TYLCV的檢測,檢出率為69.79%,該病檢出率高于前者。表明陜西關(guān)中地區(qū)番茄產(chǎn)區(qū)溫室大棚內(nèi)番茄上存在兩種病害復合侵染的情況。(4)本研究在穩(wěn)定RT-PCR檢測方法的同時,運用實時熒光定量PCR的檢測方法,進行快速鑒定,對RT-PCR檢測結(jié)果進行補充說明。通過對植株不同部位的葉片進行檢測,發(fā)現(xiàn)同一植株不同部位病毒相對含量存在差異。(5)一定稀釋比例的環(huán)保酵素不僅對番茄幼苗的生長起到了促進作用,而且也提高了番茄幼苗葉片中超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和過氧化物酶(POD)活性,說明適當稀釋比例的環(huán)保酵素可增強植株的抗逆性。但從發(fā)病調(diào)查結(jié)果和檢測結(jié)果來看,環(huán)保酵素對增強番茄植株對ToCV抗病性的作用不顯著。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S436.412.11
【部分圖文】：

圖 1-1 ToCV RNA1/2 基因組結(jié)構(gòu)示意圖Figure. 1-1 Schematic representation of the genomic structure of the RNA 1/2 of ToCVRNA 2 長8244 nt，編碼9個開放閱讀框，蛋白功能主要包括病毒的組裝、運動以及傳播。ORF 1，即p4，編碼一個分子量為3.9 KDa，起跨膜蛋白功能并且富含疏水殘基的小蛋白質(zhì)。ORF 2，即Hsp70h，編碼59 KDa的蛋白質(zhì)，該蛋白高度保守，與病毒的組裝和運動有關(guān)。ORF 3，即p8，編碼7.6 KDa的蛋白質(zhì)，該區(qū)域發(fā)現(xiàn)具有與毛形病毒屬的其他成員相似大小的基因，相同的基因組位置和序列以及中心保守的氨基酸序列。ORF 4，即p59，編碼59.4 KDa的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是病毒在細胞與細胞之間運動和組裝必不可少的。ORF 5，即p9，編碼9.3 kDa蛋白質(zhì)，具有與毛形病毒屬其他成員等同的蛋白質(zhì)編碼位置，且具有35-45%相似的氨基酸。ORF 6，即CP，編碼28.9 kDa的高度保守蛋白質(zhì)。ORF 7，即CPm，編碼76.0 kDa蛋白質(zhì)，具有與病毒傳播有關(guān)的功能。ORF 8，即p27，編碼27.0 kDa的蛋白質(zhì)，具有與同屬其他成員相似大小和基因組位置的蛋白質(zhì)，但它們之間的氨基酸相似性相對較低。ORF 9，即p7，編碼一個小的7.5kDa蛋白質(zhì)，具有富含疏水殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域，但沒有與任何已知蛋白質(zhì)具有相似性，并且在其他毛形病毒屬的成員基因組中也沒有等同物(G. Lozano et al. 2006)。

圖 3-3 To-CP-F/R-1 和 SDLC-HSP-F/R 最適引物濃度篩選（Marker：Trans5K Plus DNAmarker；A：表示引物 To-CP-F/R-1；B：表示引物 SDLC-HSP-F/R；1~10：依次表示引物濃度分別為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μM。）Figure 3-3 Screening primer concentrations on PCR detection of To-CP-F/R-1 and SDLC-HSP-F/R（Marker: Trans5K Plus DNAmarker; A: indicates primer To-CP-F/R-1; B: indicates primerSDLC-HSP-F/R; 1~10: Primer concentrations is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM , respectively .）

第三章 結(jié)果與分析μM 時，引物 To-CP-F/R-1 的退火溫度在 48.0~64.0℃范圍內(nèi)擴增效果最佳（圖 3-4），引物 SDLC-HSP-F/R 的退火溫度最適范圍是 40.9~64.3℃。高于、低于這個溫度范圍均影響擴增效率。圖 3-3 To-CP-F/R-1 和 SDLC-HSP-F/R 最適引物濃度篩選（Marker：Trans5K Plus DNAmarker；A：表示引物 To-CP-F/R-1；B：表示引物 SDLC-HSP-F/R；1~10：依次表示引物濃度分別為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μM。）Figure 3-3 Screening primer concentrations on PCR detection of To-CP-F/R-1 and SDLC-HSP-F/R（Marker: Trans5K Plus DNAmarker; A: indicates primer To-CP-F/R-1; B: indicates primerSDLC-HSP-F/R; 1~10: Primer concentrations is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM , respectively .）
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本文編號：2859709