小菜蛾(Plutella xylostella)是一種世界范圍內危害嚴重的害蟲,其主要為害十字花科植物。本研究主要對幾丁質合成酶1基因PxCHS1進行了功能分析。通過用細菌表達的靶dsRNA(dsPxCHS1)飼喂小菜蛾幼蟲來研究幾丁質合成酶1的基因沉默效果�；虮磉_分析表明,幾丁質合酶1及其兩種變體在不同的組織及不同的生命階段均有相似的表達模式,但表達量存在差異,表明在不用組織及不同發(fā)育階段對幾丁質合成酶的調控存在差異。使用RNAi對目標基因的4個不同區(qū)域進行干擾,結果表明,干擾靶基因的5’和3’端具有較好的效果,干擾5’端效果最好。生測結果表明,連續(xù)給小菜蛾飼喂dsRNA 4天后,幼蟲的死亡率與對照相比增加了約50%。飼喂dsRNA導致蛹的表型異常且延長了蛹期。由于飼喂dsRNA,蛹的尾部附著在幼蟲體上從而干擾了蛹的羽化。與對照相比,處理組的羽化率下降43.33%,而幼蟲和成蟲階段沒有形態(tài)學差異。qPCR結果表明,喂食特異性的幾丁質合酶基因dsRNA導致相對基因表達水平低于對照,具體表現為在喂食后24小時,基因表達水平比對照減少53.5%,然而,在喂食48小時后,其相對表達水平卻上升,表明攝入的RNAi的瞬時效應。通過對小菜蛾幼蟲進行Illumina測序后發(fā)現了1348個新基因,并在COG(140)、GO(406)、KEGG(308)、KOG(488)、Pfam(573)、Swiss-Prot(402)、eggNOG(1003)和nr(1335)數據庫中進行了注釋。轉錄組數據表明,RNA降解和剪接體途徑相關基因、Lsm蛋白在飼喂dsPxCHS1的幼蟲中下調,表明減少了mRNA的降解。但要明確dsPxCHS1的對小菜蛾基因表達調控的影響,尚需進一步深入研究。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S433.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
Abbreviations
CHAPTER 1: RNAi for gene functional analysis and pest control, a Review
    1 Introduction
    2 Biology, Ecology and Management of Diamondback moth
        2.1 Diamondback moth: A Chinese perspective
        2.2 Basic biology
        2.3 General life cycle
        2.4 Current DBM management strategies
        2.5 Environmental friendly integrated pest approaches -Biological control of DBM
    3 Chitin synthases in Insects
        3.1 Regulation of insect chitin synthases
    4 RNA interference
        4.1 RNAi pathways and mechanism
        4.2 RNAi for insect pest management
        4.3 Factors affecting RNAi efficiency
    5 RNAi for gene functional analysis
CHAPTER 2: Gene cloning and Functioanl analysis of chitin synthase gene1
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 Insects
        2.2 Vectors
        2.3 Gene
        2.4 Enzymes and Kits
        2.5 Microbiological media
        2.6 Stock solutions
        2.7 Main reagents for plasmid extraction
        2.8 Gene cloning
        2.9 Polymerase Chain Reaction
        2.10 Gel Electrophoresis and Purification
        2.11 Ligation
        2.12 Preparation of competent cells for transformation
        2.13 Confirmation of transformed bacteria by PCR and Plasmid digestion
        2.14 ds RNA vector construction
        2.15 IPTG induction for ds RNA production
        2.16 RNA digest
        2.17 Bioassay of the transformed bacteria expressing ds RNA
        2.18 Gene expression analysis
        2.19 Statistics and Data analysis
    3 Results
        3.1 Gene cloning
        3.2 Gene expression analysis of Px CHS1
        3.3 ds RNA production confirmation in bacteria
        3.4 Effect of ds RNA feeding on DBM larvae mortality
        3.5 Effect on growth parameters
        3.6 Effect of ds RNA feeding time on gene expression
    4 Conclusion
CHAPTER 3: Differential gene expression analysis upon ds RNA feeding
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 ds RNA feeding and sample preparation for RNA- seq
        2.2 RNA isolation c DNA library construction and Illumina sequencing
        2.3 De Novo transcriptome assembly, annotation and differential expression analysis
    3 Results
        3.1 Sequencing and de novo assembly of the P. xylostella transcriptome and differential geneexpression analysis
        3.2 Functional annotation
        3.3 Gene ontology （GO） and clusters of orthologous groups （COG） classification
        3.4 Functional annotation of differentially expressed genes （DEGs）
    4 Conclusion
CHAPTER 4: General Discussion and Conclusion
    4.1 Discussion
    4.2 Conclusion
Reference
Acknowledgements
Author information

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本文編號：2851074