大豆孢囊線蟲(SCN)是我國大豆產區(qū)最嚴重的病害之一,嚴重影響大豆的產量和品質,已成為制約我國大豆產業(yè)發(fā)展的瓶頸。本研究選用ISSRs分子標記技術,將從核DNA水平研究中國境內大豆孢囊線蟲17個不同地理種群的遺傳多樣性及遺傳分化水平,從而闡明大豆孢囊線蟲在中國的傳播與擴散機制,為大豆孢囊線蟲病的可持續(xù)控制提供理論依據。主要研究結果如下:(1)2009年~2017年在黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西、河南、江蘇、安徽、湖北、浙江、福建、江西、廣東、廣西、貴州等17省116縣開展大豆孢囊線蟲病害調查,共采集336份樣土,其中16省105縣256份樣土有孢囊線蟲檢出,總檢出率為76.20%。我國東北大豆產區(qū)齊齊哈爾孢囊密度最大,孢囊數達366.8個/200g土,其次為松原283.0個/200g土;黃淮地區(qū)山西孢囊檢出數量最多,平均孢囊數為28.3/200g土;華南等地為零星分布,偶有發(fā)生,平均孢囊數為0.8~3.5個/200g土。(2)分離獲得19個種群孢囊線蟲,經形態(tài)學鑒定,認定17個種群為大豆孢囊線蟲,2個種群為旱稻孢囊線蟲,擴增146頭孢囊的rDNA-ITS區(qū),測序并上傳NCBI注冊,用Neighbor-Joining方法聚類建樹,17個群體與大豆孢囊線蟲親緣相似度達98%,2個種群與旱稻孢囊線蟲為同一分支,與形態(tài)學結果一致。從ITS分子特征上,17個大豆孢囊線蟲群體ITS片段的差異小于2%,2個旱稻孢囊線蟲群體ITS片段的差異小于1%,表明ITS用于孢囊線蟲的分類合適,是孢囊線蟲DNA條形碼的潛在選擇基因,種群間遺傳多樣性與遺傳分化無法體現。(3)通過參考文獻選定12條ISSRs引物,篩選出對大豆孢囊線蟲擴增清晰,多態(tài)性較多引物,最終確定3條引物PTY26、PTY188和PTY888擴增效果較好,同時建立大豆孢囊線蟲ISSRs體系并對各反應因素優(yōu)化。結果表明當PCR總體系為25μL,dNTPs用量為1.5μL、引物用量為0.8μL、DNA模板用量為1.2μL、DNA Taq聚合酶用量為0.34μL、10×PCR Buffer(Mg~(2+)plus)用量為2.5μL;退火溫度55℃時條帶較明顯且清晰,擴增效果較好,該反應體系可獲得大豆孢囊線蟲ISSRs清晰且多態(tài)性高的圖譜以便后續(xù)研究分析。(4)統計135頭孢囊屬于14個地理種群,3條引物共擴增58條譜帶,50條為多態(tài)性條帶,多態(tài)位點百分率(PPB)為86.21%。引物PTY26、PTY188和PTY888分別擴增不同長度條帶18、19、21條,多態(tài)性條帶分別15、16、19條,多態(tài)位點百分率分別為83.33%、84.21%、90.48%。結果表明供試線蟲材料有很好的ISSRs多態(tài)性。(5)對供試SCN計算遺傳距離得出聚類圖,并進行遺傳多樣性分析,結果表明:本試驗中14個地理種群SCN遺傳距離范圍為0.0984~0.4098,齊齊哈爾和大慶的遺傳相似度最低,遺傳距離最大;內蒙古扎蘭屯和松原的遺傳相似度最高,遺傳距離最小。通過軟件計算出遺傳相關數據,有效等位基因數(Ne)為1.3377,Nei’s基因多樣性指數(He)為0.2087,Shannon’s多樣性指數(I)為0.3287;14個種群總的遺傳多樣性Ht指數為0.2087,種群內遺傳多樣性Hs指數為0.0648,基因分化系數Gst指數為0.6893,表明大豆孢囊線蟲的遺傳變異主要存在于種群間,基因流Nm為0.2255,說明不同地理群體間基因交流較少。進行多態(tài)性分析后表明,試驗所用SCN種群間地理距離不能作為遺傳距離的依據,且14個種群間和種群內有較高的遺傳分化和遺傳多樣性。本研究結果對闡明大豆孢囊線蟲的進化機理、研究大豆孢囊線蟲的生理小種及毒力變化研究具有重要的理論價值和實踐意義。
【學位單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S435.651
【部分圖文】：

作兩年的樣品孢囊檢出數量為 61 個/200g 土；晉城 4 份樣品采集自不 919.3m 的樣品孢囊檢出數量最多，達 96 個/200g 土，其余 3 份均小于 5 份樣品耕作方式均為輪作（前茬玉米），其中種植蒙豆 13 品種孢囊植蒙豆 1137 品種最少。品中各大豆種植品種、各耕作方式均有孢囊檢出。土壤類型有黑鈣土、草甸土、沙壤土、腐殖土、沖積土、白漿土、草炭土，均有孢囊檢中的居多，草炭土其次，兩份草甸土孢囊數差距較大，估計和種植品沖積土和腐殖土中最少。1，本試驗調查點中黑龍江西部（齊齊哈爾、大慶市）、吉林北部（松公主嶺）等地孢囊密度大，達到 200.0 個/200g 土以上，其中齊齊哈個/200g 土，孢囊密度最大，對大豆產量損失及其嚴重；吉林省西北中部偏南（遼源市）、河北省東部（滄州市）、山東省中部（泰安市）、江蘇省西北部（徐州市）、安徽省北部（宿州市）、湖北省中部偏省北部（杭州市）、福建省中部（三明市）、廣東省中部（廣州市）、安順市）樣品孢囊線蟲數在 2.0 個/200g 土以下，危害相對較輕。

最后延伸步驟 72℃ 10min最后保存溫度 4℃提取的 DNA 進行 PCR 擴增并設置無 DNA 的陰性對照；擴增后，取 5μL PC 1μL 6×Loading Buffer 充分混合，在 1%的瓊脂糖凝膠上 100V 電泳 40 min，用 1μL 4S Green Plus Nucleic Acid Stain 進行染色，用 DL 2000 DNA maker（p）作為凝膠條帶的標記，電泳緩沖液為 1×TAE，之后在 Bio-RAD 凝膠成像拍照和保存。有清晰明亮條帶的樣品擴增產物送至上海生物工程有限公司進行測序、拼 上進行序列比對并上傳至 GenBank，得到序列登錄號。結果 ITS 擴增結果驗在形態(tài)學基礎上對飽滿線蟲樣品 rDNA-ITS 區(qū)進行擴增，舍棄條帶不清晰多個條帶的線蟲樣品，最終成功擴增出 146 頭孢囊線蟲 rDNA-ITS 區(qū)，部分圖如圖 2.1，擴增得到約 1000bp 長度明亮整齊的條帶，條帶明亮說明 DNA 合之后的 ISSRs 試驗。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3.2 使用引物 PTY26 不同退火溫度的 ISSRs 擴增試M：DL 2000 maker；1-4：49℃，52℃，55℃，58℃。2 ISSRs amplification of Anneal Temperature by PTY26nes M:DL2000 DNA marker;Lanes 1-4:49℃ ,52℃ ,55℃ ,5NTPs、Taq 聚合酶、引物、DNA 模板四因素進增結果得到一個較為直觀的對比，如圖 3.3 所示出條帶越不清晰，用量在 1.0μL～1.5μL 時效果較時效果相對較好；Taq DNA 聚合酶用量為 0.2μL好；模版 DNA 用量對擴增效果無明顯影響。擴 dNTPs 1.5μL、Taq 聚合酶 0.3μL、引物 1.0μLTY26。3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
【參考文獻】

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本文編號：2849028