草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)屬于花椰菜花葉病毒屬,本研究克隆了SVBV安徽分離物(SVBV-AH)的全長基因組;利用SVBV-AH全長成功完成侵染性克隆的構建,明確了安徽分離物侵染森林草莓(Fragaria vesca)引起的表型。本課題組已證明SVBV編碼的P6蛋白是一個沉默抑制子、反式激活因子和癥狀決定子,與致病性密切相關。但迄今為止,SVBV P6蛋白與森林草莓蛋白互作的研究尚未見報道。本課題組構建感染SVBV的森林草莓酵母cDNA文庫,以P6為誘餌蛋白篩選出與其互作的寄主因子半胱氨酸蛋白酶RD21。利用酵母雙雜交實驗(Y2H)驗證P6蛋白和RD21蛋白在體外互作,且RD21蛋白能抑制P6在植物體內的表達,為進一步揭示SVBV P6蛋白與草莓半胱氨酸蛋白酶RD21互作分子機制為研究寄主植物和病毒之間防御和反防御機理奠定基礎。1 SVBV安徽分離物全長基因組的克隆提取于安徽長豐采集到的疑似被SVBV侵染的草莓樣本總DNA。PCR以此為模板分段擴增出SVBV-AH片段,拼接后獲得pSVBV-AH全長基因組。SVBV-AH基因組序列全長7862 bp,序列登錄號為KX787430。比對基因組全序列發(fā)現(xiàn),SVBV-AH與SVBV-BJ及SVBV-SY全基因組序列相似性極高,分別達到97.7%和98.5%,與SVBV-US的序列相似性較高達到85.6%,而與花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus)其他成員全長基因組序列相似性較低,僅達到43.4%~44.7%。進一步比對各ORFs核苷酸序列發(fā)現(xiàn)SVBV-AH和SVBV-US的ORF II序列差異最大,相似性僅為69.6%,ORF V序列差異最小,相似性為86.5%,說明SVBV在和草莓相互適應過程中不會因為地理隔離發(fā)生較大的變異。2 SVBV-AH侵染性克隆的構建及其侵染性鑒定利用SVBV全長基因組克隆pSVBV-AH構建SVBV-AH侵染性克隆pBIN-1.25AHSVBV,轉化農桿菌GV3101,接種森林草莓驗證侵染性。6周后觀察發(fā)現(xiàn),接種SVBV-AH侵染性克隆的森林草莓表現(xiàn)明顯的葉脈鑲邊黃化癥狀,而接種pBINPLUS的栽培草莓不表現(xiàn)明顯癥狀。Southern blot檢測表明,SVBV-AH侵染性克隆可以成功侵染森林草莓。3酵母雙雜(Y2H)驗證P6與RD21互作pGBK-P6+pGAD-RD21、pGBK-P6+pGAD-RD21分別共轉化酵母Y2H;在SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/不同營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn),共轉化的酵母菌能夠在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長,說明P6能夠與RD21在體外互作。4森林草莓RD21基因的序列比較及分子進化分析將本研究克隆獲得的森林草莓RD21基因與已登錄在GenBank的其他植物的RD21基因進行核甘酸序列相似性比較,結果發(fā)現(xiàn),森林草莓半胱氨酸蛋白酶RD21的核苷酸序列與同屬薔薇科的梅花(Prunus mume)、蘋果(Malus x domestica)、櫻桃(Prunus avium)、梨(Pyrus x bretschneider)和桃(Prunus persica)的核苷酸序列相似性較高,為83.5%-84.8%,與其他植物RD21基因序列的相似性較低,為67.4%-76.5%。構建森林草莓RD21基因和其他植物RD21基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結果表明森林草莓RD21基因與同屬薔薇科植物的梅花(P.mume)、蘋果(M.domestica)、櫻桃(P.avium)、梨(P.bretschneideri)和桃(P.persica)RD21基因單獨聚為一個分支,表明森林草莓RD21基因與薔薇科植物RD21基因的親緣關系最近。5 Real-time PCR分析森林草莓RD21基因的RNA積累水平SVBV-US侵染性克隆侵染森林草莓35天后,提取發(fā)病新葉總RNA,Real-time PCR分析接種空菌株草莓和接毒草莓中RD21基因的表達差異,結果表明,SVBV-US侵染的森林草莓中RD21表達上調。6森林草莓RD21亞細胞定位及與P6蛋白共定位分析含質粒pCM2300-RD21-GFP和pCM2300-P6-RFP的農桿菌共浸潤本氏煙,結果表明,RD21蛋白能夠定位于本氏煙的細胞質、細胞核邊界,共定位實驗發(fā)現(xiàn),P6蛋白能夠與RD21蛋白共定位于細胞邊界。7森林草莓RD21抑制P6在植物體內的表達將含有pGR106-P6-GFP/pGR106和pGR106-P6-GFP/pGR106-RD21表達載體的農桿菌分別注射本氏煙,4天后UV燈下觀察熒光發(fā)現(xiàn),pGR106-P6-GFP/pGR106-R D21浸潤的葉片中綠色熒光較弱,提取浸潤區(qū)蛋白進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)檢測不到P6蛋白的表達,同時檢測P6 mRNA發(fā)現(xiàn),P6 mRNA表達水平一致,說明RD21蛋白能夠抑制P6-GFP的表達。
【學位單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.68
【部分圖文】：

圖 1-1 SVBV 基因組結構Fig. 1-1 Genomic organization of SVBV毒侵染性克隆于植物中時應具有如下特點：1. 病毒復制組較小易于體外操作；3. 侵染性克隆方便克隆，而其中雙生病毒應用范圍最廣泛，A病毒也是早期被用于制備侵染性克隆的些局限性，如易重組、復制和組裝能力有圍越來越廣泛，這一切都得益于逆轉錄酶性克隆可用以研究病毒各個基因的功能制和寄主的互作等，從中我們可以獲取大的發(fā)展，如今植物病毒的侵染性克隆可被[22,23]

pC2-0.5SVBV-AH。（2）以 AH-C1-F 和 AH-C1-R 為引物，以 AHSVBV-II 為模版獲得片段，命名AHSVBV-III，與線性化載體 pC1-SVBV-I（Sal I/Kpn I）以重組法相連，得pC1-0.75SVBV-AH。（3）限制性內切酶 Bsp1407 I/Sma I 酶切 pC2-0.5SVBV-AH，得到純化產物 0.5SVB（Bsp1407 I/Sma I），與線性化載體 pC1-0.75SVBV（Bsp1407 I/Sma I）連接，到 pC1-1.25AHSVBV。（4）限制性 Sal I/Sma I 酶切 pC1-1.25AHSVBV 后，經膠回收后獲得 1.25AHSVBV（SI/Sma I）純化產物，直接與載體 pBINPLUS（Sal I/Sma I）連接，獲得質pBIN-1.25AHSVBV。

圖 4-2 SVBV-AH 基因組結構特點Fig. 4-2 Structural characteristics of SVBV-AH genome 基因組序列與另外 16 個花椰菜花葉病毒屬（列（表 4-2），結果發(fā)現(xiàn) SVBV-AH 全長基因高，分別為 98.5%和 97.7%，與 SVBV-US 的VBV-AH 基因組全長序列與其他 13 個 Cauli3.4%~44.7%（表 4-3）。 ORFs 編碼的氨基酸序列與已知的 SVBV 其他BV-AH 和 SVBV-US 的 ORF II 序列差異最大，，相似性為 93.4%。對比 4 個 SVBV 序列也似性高達 93.4%~99.0%，此外 SVBV-AH 和 S酸序列相似性極高，為 95.1%~99.0%，說明 S地理隔離發(fā)生較大的變異。 Caulimovirus 其他 13 個成員各 ORFs 氨基酸
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本文編號：2845789