鏈格孢菌在侵染棗果后會引起棗黑斑病,迫使棗果在生理、組織、形態(tài)上發(fā)生一系列變化,進而導致產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降,它不僅會造成產(chǎn)中損失,還會對產(chǎn)后造成損失,這給棗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)和貯藏造成了巨大的經(jīng)濟損失。本文以引起棗黑斑病的鏈格孢菌為研究對象,解析鏈格孢菌細胞壁降解酶和毒素在侵染棗果發(fā)病過程中的作用,闡明了鏈格孢菌侵染棗果的生化機制以及侵染過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,為鏈格孢菌侵染棗果后引起的棗黑斑病防治提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.棗果黑斑病菌的分離及形態(tài)學鑒定采用組織分離法對病樣進行分離,共獲50株微生物,其中,鏈格孢菌占78%,青霉菌占8%,鐮刀菌占4%,黑曲霉菌占10%。將分離得到的菌株回接于健康駿棗,對其進行致病性測定,僅鏈格孢菌可致使棗果發(fā)病,發(fā)病率為54%。再次分離接種后發(fā)現(xiàn)致病鏈格孢菌與第一次分離得到的鏈格孢菌一致,確定分離得到的鏈格孢菌為棗黑斑病主要致病菌,并根據(jù)菌株的形態(tài)特征初步鑒定為鏈格孢屬鏈格孢菌Alternaria alternata。分離出的A3組單孢菌株經(jīng)驗證具有較強的致病性,可用于后續(xù)鏈格孢菌侵染的研究。2.鏈格孢菌侵染棗果過程中細胞壁降解酶活性分析采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法和考馬斯亮藍(Bradford)法對鏈格孢菌細胞壁降解酶的活性進行分析,測定酶反應所釋放的還原糖并計算細胞壁降解酶的活性。鏈格孢菌在寄主體外不同碳源誘導下均能產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶和果膠甲基反式消除酶等6種細胞壁降解酶,但不同細胞壁降解酶的活性存在一定差異,以駿棗果肉為外源誘導物,鏈格孢菌產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶活性明顯高于其它5種酶,說明β-葡萄糖苷酶在鏈格孢菌致病過程中有著重要的作用。以濾紙為誘導物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性高于其他誘導物,其活性高達10.104 U/mg。鏈格孢菌侵染棗果后產(chǎn)生的細胞壁降解酶種類及活性與體外不同碳源誘導的結(jié)果一致,可產(chǎn)生6種細胞壁降解酶。其中β-葡萄糖苷酶活性高于其他5種酶,且病健交界處β-葡萄糖苷酶的活性明顯高于受侵染后的發(fā)病部位和未被侵染的部位。該測定結(jié)果表明鏈格孢菌在致病過程中起關鍵作用的細胞壁降解酶為β-葡萄糖苷酶,且在侵染過程中病健交界處的活性最高,在寄主體外誘導β-葡萄糖苷酶最佳碳源為濾紙誘導物。3.鏈格孢菌侵染棗果過程中毒素對駿棗果皮的脅迫作用利用鏈格孢菌毒素提取液處理棗果皮組織,并測定其細胞膜透性,同時測定了丙二醛含量以及過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶的活性,研究了該毒素的致病機制。結(jié)果顯示,鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素,能抑制細胞組織中活性氧清除酶的活性,其中過氧化氫酶的活性在短時間內(nèi)下降了67.06%,導致細胞中的活性氧高濃度積聚,擾亂了機體的正常代謝,造成細胞損傷,使其失去正常的生理功能。由于細胞膜的損壞,會造成電解質(zhì)滲漏,電導率則呈上升趨勢,相對電導率極差最大為33%。丙二醛含量呈上升趨勢,最高可達36.6nmol/g,膜脂過氧化程度加深,因此丙二醛的含量同樣可以作為細胞損傷程度的標志。毒素處理后,細胞損傷程度加深,最終會引起寄主死亡。研究結(jié)果表明鏈格孢菌的毒素對駿棗具有脅迫作用,反映了致病性和毒素的關系。4.鏈格孢菌侵染棗果過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化為了探究鏈格孢菌侵染棗果過程形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,利用綠色熒光蛋白基因(GFP)標記該菌株,通過分子轉(zhuǎn)化體系研究病原菌侵染過程。將帶有GFP標記的鏈格孢菌接種于棗果體內(nèi),6h時在棗果實表面可明顯觀察到孢子萌發(fā);接種后12h,萌發(fā)形成的芽管逐漸伸長;24h時形成了稀疏的單根菌絲,侵入到表皮細胞內(nèi);接種后48h,在棗果實組織內(nèi)部充斥著密集的菌絲體,并朝不同的方向生長。棗果被侵染后,黑色病斑逐漸擴大,病斑中心部分下陷,果實皺縮變干;經(jīng)鏈格孢菌入侵的病棗組織細胞有破損,在細胞間隙和細胞中存在大量菌絲,組織細胞形狀發(fā)生變化。從組織病理學的角度觀察了GFP標記的鏈格孢菌侵染棗果后形態(tài)結(jié)構(gòu)變化過程,為鏈格孢菌-寄主互作關系提供依據(jù)。
【學位單位】：塔里木大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S436.65
【部分圖文】：

其范圍為 1-2mm；圖 2-1 f 為切開后癥則形狀的水漬狀小病斑，有黑色霉狀物產(chǎn)生。皮下組織變褐壞死，病組織易剝離。以上結(jié)果狀不明顯，采用菌塊貼接法接種后有明顯的發(fā)3 組鏈格孢菌菌株具有較強的致病性。表 2-2 不同病原菌的發(fā)病率Table 2-2 Incidence of different pathogens真菌種類Fungal species株數(shù)Number ofshares接種數(shù)Number ofvaccinations發(fā)病Inciderate（格孢菌 Alternaria 10 50 54霉菌 Penicillium 4 20 0刀菌 Fusarium 2 10 0菌 Aspergillus niger 5 25 0

注：a-b 產(chǎn)孢表型；c 分生孢子；e-f 菌落圖 2-2 分生孢子和菌落Note: a.Sporulation phenotype;b.strain conidia；e-f.ColonyFigure 2-2 conidia and Colony2.3 討論從新疆生產(chǎn)建設兵團第一師周邊團場紅棗種植區(qū)采集分離病原菌，對棗樹果實病害棗黑斑病的病原菌進行鑒定，本試驗采用常規(guī)組織分離法對病樣進行分離[41]，并對病原物經(jīng)行了單孢純化，鏈格孢菌占總分離菌株總數(shù) 78%；通過致病性檢測青霉菌、鐮刀菌和黑曲霉菌等均不發(fā)病。對鏈格孢菌進行致病性檢測，發(fā)現(xiàn)接種后的棗果有明顯的發(fā)病現(xiàn)象。向征[42]從南疆棗樹產(chǎn)區(qū)的棗園中采集了大量有棗黑斑病發(fā)病癥狀的果實，并從病樣中分離菌株，經(jīng)培養(yǎng)后觀察，菌落正反面有同心螺紋與本試驗所得結(jié)果相似。本試驗中鏈格孢菌接種棗果后有明顯發(fā)病癥狀，通過致病性檢測，鏈格孢菌的發(fā)病率為 54%，

圖 3-1 半乳糖醛酸標準曲線Fig.3-1 standard curve of galacturonic acid導物對細胞壁降解酶活性的影響，在 6 種碳源培養(yǎng)條件下，棗黑斑病菌均能產(chǎn)生多β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶和解酶，表明棗黑斑病菌可產(chǎn)生多種類型的細胞壁降基中，6 種細胞降解酶酶活性存在一定差異。在果的聚甲基半乳糖醛酸酶和多聚半乳糖醛酸酶活性分顯高于其它 4 種酶，且顯著高于其他培養(yǎng)基產(chǎn)生的醛酸酶活性；同樣，在濾紙誘導培養(yǎng)基中，β-葡萄高于其他培養(yǎng)基產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶；羧甲基纖維素 7.75 U/mg，與其他培養(yǎng)基產(chǎn)生羧甲基纖維素酶存
【參考文獻】

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本文編號：2844791