昆蟲的天然免疫分為細胞免疫(cellularimmunity)和體液免疫(humoral immunity)。昆蟲的細胞免疫是指多種血細胞參與的防衛(wèi)反應,包括吞噬作用(cytophagy)、結(jié)節(jié)形成(nodulation)和細胞包囊(encapsulation);體液免疫涉及抗菌肽的誘導、酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)激活導致的黑化反應(melanization)。絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor,Serpin),是血淋巴中對絲氨酸蛋白酶有抑制作用的一類蛋白質(zhì),用來調(diào)節(jié)昆蟲內(nèi)環(huán)境的平衡。β-1,3-葡聚糖識別蛋白(β-1,3-glucanrecognitionprotein,βGRP)作為一種模式識別蛋白,能夠識別真菌的細胞壁成分,在昆蟲的免疫系統(tǒng)中占有重要地位。本文利用RT-PCR和RACE擴增技術(shù),克隆了亞洲玉米螟幼蟲Serpin2基因的全長cDNA序列。該基因全長1447bp核苷酸,其中包含一個1137bp的開放閱讀框(ORF),一個163 bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和一個147bp的帶有加尾信號的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。開放閱讀框從第164個核苷酸開始,終止于第1300個核苷酸,共編碼378個氨基酸。Of-Serpin2的計算分子量約為41.71kDa,估測等電點pI為5.29。生物信息學分析表明:Of-Serpin2無跨膜結(jié)構(gòu)域,N端無信號肽,不存在糖基化位點,含有39個磷酸化位點,均勻分布于整個多肽鏈中。BlastP分析結(jié)果表明:Of-Serpin2的氨基酸序列與尺蠖Lonomia obliqua Serpin2、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua Serpin2、野桑蠶 Bombyx mandarina Serpin2、家蠶 Bombyx mori Serpin2、大斑蝶Daanaus plexippus Serpin2高度同源。三維結(jié)果顯示,Of-Serpin2有8個α螺旋,3個β折疊。利用RNA干擾技術(shù),研究干擾βGRP3基因后亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)與體液免疫相關(guān)基因Serpin1、PAP、PPO等的表達情況,以及對細胞免疫能力的初步影響。以DEPC水處理組和綠色熒光報告蛋白(GFP)處理組為陰性對照,制備了βGRP3和GFP的dsRNA,采用注射方法,分別將βGRP3和陰性對照GFP的dsRNA導入4齡初亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi),采用實時熒光定量PCR檢測RNAi后幼蟲體內(nèi)Serpin1、PPO、PAP等免疫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化,進一步分析RNAi對血淋巴中PO活性的影響,探索βGRP3在亞洲玉米螟免疫識別和防衛(wèi)過程中的功能。結(jié)果表明:將βGRP3基因干擾后72h,亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)該基因的表達量開始明顯降低(P0.05),表明注射βGRP3dsRNA可以有效下調(diào)βGRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平。與此同時,其免疫相關(guān)基因PAP(酚氧化酶原激活蛋白酶)、PPO(酚氧化酶原)的表達量也顯著低于對照;干擾后幼蟲體內(nèi)PO酶活性在72 h開始呈現(xiàn)顯著下調(diào),這表明Of-βGRP3正調(diào)控PO活性,即在PPO級聯(lián)調(diào)控中起重要作用。對干擾后亞洲玉米螟幼蟲血細胞觀察發(fā)現(xiàn),72h開始,類絳色細胞、漿血細胞和原血細胞的數(shù)量開始下降(P0.05),而粒血細胞數(shù)量增加,且漿血細胞在96 h后的數(shù)量開始回升,同時與對照組相比,處理組的總細胞數(shù)并沒有發(fā)生明顯變化(P0.05),說明宿主昆蟲在受到外來入侵物影響時,其血細胞會自行進行免疫調(diào)節(jié),以維持宿主昆蟲體內(nèi)的正常生理活動。RNAi后再次注射細菌,發(fā)現(xiàn)只注射大腸桿菌處理組的致死中時間(3d)顯著大于RNAi處理后二次注菌處理組(1 d),結(jié)果表明:βGRP3在昆蟲抵抗病原菌侵染中起重要作用。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S435.132
【部分圖文】：

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本文編號：2843801