甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)NJ13菌株是一株對(duì)人參銹腐病菌(Ilyonectria robusta)具有較好防病效果的生防菌株。本研究開(kāi)展了NJ13菌株與人參銹腐病菌DQX01的互作研究,確定了抑制銹腐病菌孢子萌發(fā)的互作關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn),通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了互作過(guò)程中的NJ13菌株的基因差異表達(dá)變化和基因表達(dá)譜,以期了解NJ13中可能參與抑制DQX01孢子萌發(fā)的基因。具體試驗(yàn)結(jié)果如下:1.室內(nèi)顯微觀察測(cè)定了NJ13對(duì)DQX01孢子萌發(fā)的影響,發(fā)現(xiàn)相比于清水對(duì)照組,加入NJ13處理的DQX01的孢子萌發(fā)率明顯降低,NJ13對(duì)DQX01孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)60%以上。同時(shí)DQX01的孢子形態(tài)隨著兩菌株共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),孢子逐漸膨大呈“念珠”形狀。試驗(yàn)確定接種NJ13后共培養(yǎng)3 h為兩菌株互作關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。2.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得了13.73 G數(shù)據(jù)量。以|log2(FoldChange)|5為高表達(dá)差異基因選擇標(biāo)準(zhǔn),共獲得高表達(dá)差異基因51個(gè)(上調(diào)16個(gè),下調(diào)35個(gè))。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行顯著性富集分析,發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要富集在分子功能的碳水化合物運(yùn)輸、離子跨膜運(yùn)輸?shù)?以及參與生物學(xué)過(guò)程的碳水化合物代謝、維生素代謝等。同時(shí),對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行了代謝通路分析。3.從高表達(dá)的基因中,挑選出6個(gè)基因分別進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的qPCR表達(dá)量分析。結(jié)果顯示,在互作3 h時(shí),基因表達(dá)量最高,隨著時(shí)間延長(zhǎng),基因的表達(dá)值皆有下降的趨勢(shì),說(shuō)明互作的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)3 h的選擇較為準(zhǔn)確。熒光定量結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的上調(diào)差異表達(dá)基因經(jīng)檢測(cè)表達(dá)量依舊上調(diào),下調(diào)差異表達(dá)基因經(jīng)檢測(cè)表達(dá)量依舊下調(diào),檢測(cè)結(jié)果同轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。4.從高表達(dá)的基因中,選取并設(shè)計(jì)36個(gè)不同基因的引物進(jìn)行克隆驗(yàn)證,驗(yàn)證目的基因與原始差異基因的相似度,確保轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得基因的準(zhǔn)確性。經(jīng)克隆成功驗(yàn)證24個(gè)目的基因。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.675;S476
【部分圖文】：

由孢子萌發(fā)數(shù)據(jù)（表 2-1）及孢子萌發(fā)柱形圖（圖 2.1）可知。人參銹腐病菌在孢子萌發(fā)率明顯提高，萌發(fā)率達(dá)到 10%以上。因此，選擇 3 h 作為加入 NJ13 生初始時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行病原菌與生防菌互作培養(yǎng)。表 2-1、不同時(shí)間孢子萌發(fā)率Table 2-1. Spore germination rate at different times時(shí)間(h) 萌發(fā)率（%） 5%顯著水平23456713.65±0.7214.70±2.7729.10±2.0268.65±3.8477.55±1.4186.30±0.87eedcba

表 2-2、不同時(shí)間孢子萌發(fā)抑制率Table 2-2. Spore germination inhibition rate at different times時(shí)間（h） 抑制率（%） 5%顯著水平1 61.60±10.42 a2 65.26±5.58 a3 62.56±5.18 a4 50.30±3.91 a5 48.55±3.53 a6 47.14±1.59 a12 18.05±3.29 b

圖 2.3 孢子萌發(fā)顯微圖，A-H 分別為加入 NJ13 處理 0h，1h，2h，3h，圖, J-Q 分別為清水處理 0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h, 12h 后的Fig. 2.3 Microscopy of spore germination,A-G was treated with NJ112h, 24h. H-N was treated with water for 0h, 1h, 2h, 3h, 4h,由顯微圖片可知，加入生防菌 NJ13 處理 2 h 之前，銹腐入生防菌 NJ13 處理 3 h 時(shí)，銹腐病菌孢子開(kāi)始逐漸膨大，呈12h 時(shí)，可觀察到孢子萌發(fā)長(zhǎng)出的芽管畸形，由此可知，生防明顯的拮抗作用，可導(dǎo)致孢子膨脹和芽管畸形。2.4 小結(jié)芽孢桿菌屬細(xì)菌是自然界優(yōu)勢(shì)的微生物種群，該屬細(xì)菌大畜無(wú)害，而且多數(shù)種類具有抑制植物病原菌生長(zhǎng)的能力。芽孢要表現(xiàn)在對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制和對(duì)孢子萌發(fā)的影響這兩個(gè)方面。孢桿菌 NJ13 對(duì)人參銹腐病菌 DQX01 孢子萌發(fā)的影響。通過(guò)微觀察兩個(gè)方面驗(yàn)證了 NJ13 對(duì) DQX01 孢子萌發(fā)的抑制作用。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2836135