桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)是一種危害性非常高的果蔬害蟲,常見于熱帶以及亞熱帶地區(qū),其寄主范圍很廣,造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。由于桔小實(shí)蠅具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)以及擴(kuò)散入侵能力,其已被多個(gè)地區(qū)和國家當(dāng)作檢疫性害蟲而加以隔離,對(duì)國際貿(mào)易造成了諸多限制。因此,桔小實(shí)蠅被一些昆蟲學(xué)家和生物學(xué)家列為世界上最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。目前,桔小實(shí)蠅的防控主要以化學(xué)藥劑為主,然而由于殺蟲劑的不合理使用,導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染并且使其抗藥性發(fā)展非常迅速。研究表明,昆蟲蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調(diào)控其生長發(fā)育及生殖進(jìn)程。因此,開展桔小實(shí)蠅生殖進(jìn)程中關(guān)鍵基因的調(diào)控機(jī)制研究,將有利于發(fā)掘新的殺蟲作用靶標(biāo),并為實(shí)蠅類害蟲的持續(xù)防控提供新思路和方法,具有重要的研究意義。本論文參考桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組以及基因組數(shù)據(jù)信息庫,克隆獲得了JH信號(hào)通路BdMet和BdKr-h1基因的ORF序列,同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了序列結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)發(fā)育分析;利用qRT-PCR解析了桔小實(shí)蠅雌蟲BdMet和BdKr-h1的時(shí)空表達(dá)模式;在此基礎(chǔ)上探究了JH類似物烯蟲酯(Methoprene)處理對(duì)桔小實(shí)蠅相應(yīng)基因表達(dá)量及卵巢發(fā)育進(jìn)度的影響;最后,利用RNAi技術(shù)及拯救實(shí)驗(yàn)探索了BdKr-h1在桔小實(shí)蠅生殖成熟過程中的生理功能。具體的研究結(jié)果如下:1桔小實(shí)蠅BdMet和BdKr-h1 ORF的克隆及序列分析依據(jù)桔小實(shí)蠅基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息,克隆獲得JH信號(hào)通路BdMet和BdKr-h1(GenBank登錄號(hào):MG763072和MG763073)的ORF序列,隨后利用軟件DNAMAN v.6.03翻譯了其編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。并通過ClustalW、TMHMM、SignalP 4.1、ProtParam等生物信息學(xué)軟件分析了BdMet以及BdKr-h1的特殊結(jié)構(gòu),同時(shí)采用軟件MEGA 5.0完成其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。2桔小實(shí)蠅BdMet和BdKr-h1的時(shí)空表達(dá)模式解析2.1 BdMet和BdKr-h1在桔小實(shí)蠅雌成蟲不同日齡的表達(dá)模式利用qRT-PCR解析JH信號(hào)通路BdMet和BdKr-h1在桔小實(shí)蠅雌蟲不同日齡的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),BdKr-h1在桔小實(shí)蠅成蟲期均有所表達(dá),并且在1、3、5、7日齡表達(dá)量逐漸上升,7日齡達(dá)峰值隨后逐漸下降;相對(duì)而言,BdMet基因表達(dá)量波動(dòng)趨緩,表達(dá)趨勢和BdKr-h1基本一致,亦在7日齡表達(dá)量最高,暗示其在桔小實(shí)蠅生殖成熟進(jìn)程中扮演重要角色。2.2 BdMet和BdKr-h1在桔小實(shí)蠅雌成蟲不同組織的表達(dá)模式綜合分析了BdMet和BdKr-h1在桔小實(shí)蠅雌蟲馬氏管、脂肪體、后腸、中腸、精巢及卵巢等組織中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BdMet和BdKr-h1在中腸、脂肪體及馬氏管中轉(zhuǎn)錄水平均較高,而在精巢及卵巢中表達(dá)水平較低。脂肪體是卵黃原蛋白生成的重要場所,對(duì)卵黃原蛋白的形成具有重要的促進(jìn)作用,因此兩者在脂肪體高表達(dá)進(jìn)一步暗示其可能參與桔小實(shí)蠅的生殖調(diào)控進(jìn)程。3 Methoprene對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢發(fā)育進(jìn)度的影響為探究JH外源類似物Methoprene處理對(duì)桔小實(shí)蠅雌成蟲JH信號(hào)通路相關(guān)基因及BdVgs表達(dá)量的影響,采用點(diǎn)滴法以2.0μg的烯蟲酯處理1日齡雌成蟲,隨后利用qRT-PCR檢測BdMet、BdKr-h1、BdVg1以及BdVg2基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明:Methoprene處理1日齡雌成蟲后,BdMet、BdKr-h1及BdVgs轉(zhuǎn)錄水平在4、8、12、24 h均出現(xiàn)顯著性上調(diào),并且BdVgs表達(dá)量上調(diào)極顯著;與丙酮處理相比,3-7日齡的雌蟲經(jīng)Methoprene處理后其卵巢成熟進(jìn)度明顯加快,表現(xiàn)為卵巢發(fā)育形態(tài)更為飽滿。4 BdKr-h1對(duì)桔小實(shí)蠅雌成蟲生殖調(diào)控的功能解析4.1 RNAi沉默BdKr-h1對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵量的影響利用RNAi技術(shù),采用注射法探究了BdKr-h1對(duì)桔小實(shí)蠅雌成蟲生殖的影響。研究表明,BdMet被顯著沉默后,其下游BdKr-h1、BdVg1、BdVg2表達(dá)量均顯著性下調(diào);而BdKr-h1被成功干擾后,BdVg1及BdVg2表達(dá)量亦顯著下調(diào)。相較于dsGFP處理后的對(duì)照組,dsRNA干擾后的雌成蟲卵巢發(fā)育進(jìn)度明顯較慢,卵巢表面積顯著較小,產(chǎn)卵量顯著下降。4.2 Methoprene聯(lián)合RNAi對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢發(fā)育進(jìn)度的影響用BdMet以及BdKr-h1的dsRNA干擾4日齡雌成蟲2 h后,采用Methoprene點(diǎn)滴處理(2.0μg)注射后雌成蟲的前胸背板,并分別于處理24 h、72 h后收集樣品,檢測Methoprene處理對(duì)雌成蟲相關(guān)基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明,Methoprene處理,可誘導(dǎo)RNAi后的4日齡雌成蟲JH通路及BdVgs的表達(dá)量小幅度上調(diào),同時(shí)卵巢發(fā)育進(jìn)度表型能夠在一定程度上得到恢復(fù)。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.661.2
【部分圖文】：

圖 1.1 桔小實(shí)蠅的生長發(fā)育歷期Figure 1.1 Development and growth period of Bactrocera dorsalis2 昆蟲保幼激素（JH）2.1 天然保幼激素（JH）及保幼激素類似物（JHM）天然 JH 是一種倍半萜類化合物，它是在昆蟲頭部腦后的咽側(cè)體中合成并分泌的，其發(fā)揮作用的方式主要是經(jīng)昆蟲的血淋巴而擴(kuò)散到靶組織進(jìn)而體現(xiàn)其應(yīng)有的生理功能。JH 是調(diào)控昆蟲生長發(fā)育、變態(tài)與生殖最重要的激素之一[7,8]，在昆蟲幼蟲期與 20E 產(chǎn)生拮抗作用進(jìn)而抑制昆蟲的早熟變態(tài)，導(dǎo)致幼蟲發(fā)生蛻皮后仍可以保持其特定形態(tài)。在末齡幼蟲蛻皮前，JH 滴度明顯降低，進(jìn)而引發(fā)全變態(tài)類昆蟲蛻皮化蛹以及不全變態(tài)類昆蟲進(jìn)一步發(fā)育為成蟲[9]，而成蟲羽化后 JH 又可以直接作用于昆蟲的生殖成熟進(jìn)程，并促進(jìn)雄蟲附性腺以及雌蟲卵巢的生長發(fā)育[10]。此外，JH 亦可對(duì)一些昆蟲的體色、等級(jí)分化以及多型現(xiàn)象等進(jìn)行精確的調(diào)控[11,12]�；趥�(cè)鏈長度及環(huán)氧化方式的不同，昆蟲中有許多不同結(jié)構(gòu)的天然 JH。目前為止，已被發(fā)現(xiàn)的天然 JH 有 4-甲基-JH I、JHB3、JH 0、JH I、JH II、JH III、

昆蟲體內(nèi)幾種主要天然 JHs 和 JHMs（如烯蟲酯、吡丙醚、苯氧威）的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1.2 所示[15]。圖 1.2 幾種主要的天然 JH 以及三種 JH 類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1.2 Chemical structures of the active insect major natural JHs and three JH mimics2.2 保幼激素（JH）的生物合成途徑已有研究表明[15, 16]，天然 JH 通過兩個(gè)具體階段最終合成。首先是甲羥戊酸途徑，先是以一分子的乙酰輔酶 A 為原料合成法尼焦磷酸，緊接著由法尼焦磷酸最終反應(yīng)生成天然 JHIII，此合成途徑僅現(xiàn)于部分節(jié)肢動(dòng)物中。2.2.1 甲羥戊酸途徑甲羥戊酸合成途徑是一條在細(xì)菌、古細(xì)菌以及真核生物中廣泛分布的合成代謝通路[17]，該合成途徑的正常運(yùn)作可以合成許多對(duì)發(fā)育和繁殖至關(guān)重要的調(diào)控因子。經(jīng)典的甲羥戊酸合成途徑是利用一分子的乙酰 COA 在 8 種催化酶的作用下最終合成法尼焦磷酸的過程[18]。該合成途徑中的8種催化酶分別是：AACT、HMGS、HMGR、MevK、PMK、MDD、IDI 以及 FPPS，并且異戊烯焦磷酸以及烯丙基二磷酸會(huì)最終反應(yīng)生成法尼焦磷酸[19, 20]。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2.2 法尼焦磷酸最終合成天然 JHIII法尼焦磷酸最終反應(yīng)合成 JHIII 是該合成通路的最后一步，其具體反應(yīng)進(jìn)程包含法尼酸的生成和法尼酸的甲基化以及環(huán)氧化。法尼酸的合成過程是通過 3 步化學(xué)反應(yīng)并以法尼焦磷酸為底物而完成的，同時(shí)被法尼醇脫氫酶和法尼醛脫氫酶法尼酸環(huán)氧酶以及保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶等催化酶所催化并最終生成，并且法尼酸經(jīng)過環(huán)氧化以及甲基化并最終形成天然 JHIII，其具體的合成路徑如圖 1.3 所示[11]。
【參考文獻(xiàn)】

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1 張彬;劉映紅;趙嵐嵐;周旭;;桔小實(shí)蠅研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2008年11期

本文編號(hào)：2835197