水稻稻瘟病是最嚴重的水稻病害之一,稻瘟病是一種由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻病害,嚴重影響水稻產(chǎn)量,每年可導致水稻減產(chǎn)約30%。為了減少農(nóng)業(yè)損失,研究水稻與稻瘟病菌之間的相互作用已成為急需解決的問題。因此越來越多的科學家開始研究水稻與稻瘟病之間相互作用的機制,稻瘟病已經(jīng)成為研究植物與真菌之間相互作用的一種模式菌種。至今,培育廣譜、持久稻瘟病抗性的水稻品種是防治稻瘟病菌最有效的方法之一。特特普是一種具有持久稻瘟病抗性的高抗水稻品種。首先我們完成了特特普的全基因組測序,預測出37054個基因,包含455個核苷酸結合位點和富亮氨酸重復蛋白的基因(NBS-LRR類型基因,簡稱NLR基因)。我們在特特普品種中利用高通量克隆方法成功克隆了 219個NLR基因,分別轉基因至兩個感病品種TP309和Shin2中,并用12個不同的稻瘟病菌株進行鑒定。研究表明,其中90個克隆的NLR基因能夠對抗至少1種稻瘟病菌株,并且每一個稻瘟病菌株都能夠被很多個NLR基因識別,然而有很少的NLR基因能夠對抗6種以及以上的稻瘟病菌株,表明特特普NLR基因表現(xiàn)出比較高的抗性冗余現(xiàn)象,同時特特普廣譜、持久抗性可能需要多個NLR基因共同作用。為了驗證NLR基因是否存在互作,本研究從最簡單的兩個基因,即成對NLR基因入手,提出了一種快速鑒定成對NLR抗性基因的方法,其中每個基因都作為獨立的個體行使不同功能,只有當兩個NLR基因同時存在時才能引起植株的免疫反應。我們分別在特特普和日本晴、明恢63、R498其他三種基因組中發(fā)現(xiàn)大于20%的NLR基因都是成對基因,在特特普基因組成功鑒定出43對成對NLR基因,在日本晴基因組成功鑒定出47對成對NLR基因。并且選取25對成對NLR基因進行基因敲除,成功得到7對成對NLR基因敲除突變體植株,得到與其功能相對應的表型。綜上,本研究深入研究了高抗稻瘟病品種Tetep的持久、廣譜抗性的潛在抗性機制,通過對該抗性基因組進行長序列組裝、NLR基因注釋、并對其中大部分NLR基因進行克隆和抗性鑒定工作,揭示了其具有高度的抗性冗余與復雜的抗性互作網(wǎng)絡,同時進一步利用敲除實驗驗證了成對基因的頻繁互作,在此基礎上構建了能夠快速鑒定NLR基因簇和基因對的分子標記數(shù)據(jù)庫,從而推進新的高抗品種育種的進程。
【學位單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.111.41
【部分圖文】：

％］。由于自身免疫引起的遺傳負荷，使得基因對的選擇壓受到負調控作逡逑用，從而限制了基因對的擴張（圖１．６Ａ）。與之相反，撤Ｃ與依賴Ｍ？Ｃ的逡逑基因通過適應性進化機制實現(xiàn)功能，Ｗ此依賴ＮＲＣ的基因通過正調控而不逡逑是負調控作用于貓因，從而激活下游免疫反應（閣１．６Ａ）。ＮＲＣ網(wǎng)絡的進逡逑化模型會產(chǎn)生大量的基因復制和功能分化，為了維持免疫網(wǎng)絡的穩(wěn)定性，ｓｅｎｓｏｒ逡逑Ｍｌｉ？基因產(chǎn)生大量擴張，ｈｅｌｐｅｒＴＶＬ／？基因存在少量的擴張（圖１．６Ｂ），從而應對逡逑快速演化的病原菌＠４］。這種基因網(wǎng)絡現(xiàn)象不止存在于ＮＲＣ基因家族中，例如擬逡逑南芥的ＡＤＲ１家族成員（兒Ｄｉ？ｉ，＾４￡？凡？－１２）是ｓｅｎｓｏｒ邋Ｃ／ＶＬ類型基因逡逑（ｉｔｒａ２，似２）和邋７７ＶＬ邋類型基因（ｉｉＰＰ２，５／ＶＣ７，燦幻和邋ＣＨＳ７）介導逡逑免疫反應所必需的［１Ｑ６＿１（）９］。另一個擬南芥基因同樣是ｓｅｎｓｏｒ邋７７ＶＬ類型基因逡逑｛Ｒｏｑｌ

ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ邋融合序列，稱為指導邋ＲＮＡ邋（ｇｕｉｄｅ邋ＲＮＡｓ，ｇＲＮＡｓ），由邋Ｕ６邋啟逡逑動ｆ治動的起始為Ｇ，跟隨ＰＡＭ邋（ＮＧＧ）之后長度為２０ｂｐ的ｃｒＲＮＡ指導Ｃａｓ９逡逑蛋白對基因組進行剪切過程（圖１．７）邋［１３７］。逡逑到目前為止，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)己經(jīng)廣泛于細菌，真菌以及動植物的基因編逡逑輯過程。在植物中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)已經(jīng)成功運用到擬南芥，水稻，煙草和高逡逑粱上［１３８＿１４３］，最早關于ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系統(tǒng)的研宄表明成功將靶位點插入堿基，以逡逑不同的效率敲除靶基因的功能。進一步的研宄表明敲除成功的擬南芥和水稻基因逡逑能夠穩(wěn)定遺傳給下一代［１４４，１４５］。為了同時敲除多個基因，將不同基因的ｇＲＮＡ構逡逑建到同一質粒，然后指導Ｃａｓ９蛋白錨定到不同基因位點，實現(xiàn)基因的功能敲除逡逑１４９逡逑0逡逑２０逡逑

邋ｖ２．３邋？０邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｎａｌｖｔｉｃａｌ－逡逑ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｍｔｔ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）進行處理得到ｓｕｂｒｅａｄｓ邋（圖２．３）。通過篩選除掉長度低于逡逑５００ｂｐ邋或者是讀長小于邋０．８邋的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ，剩下的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ邋利用邋Ｃａｎｕ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｒ邋ｖｌ．４逡逑（參數(shù)設置“ｇｅｎｏｍｅＳｉｚｅ＝４４９ｍｏｖｓＭｅｍｏｒｙ＝４０ｇ－１００ｇ”，其余為默認參數(shù)）進行基逡逑因組草圖的組裝［１４９］。組裝得到的ｃｏｎｔｉｇｓ經(jīng)過ＳＭＲＴ分析軟件當中的Ｑｕｉｖｅｒ工逡逑２７逡逑

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本文編號：2832552