百合(Lilium spp.)觀賞品質(zhì)優(yōu)良,在世界花卉市場(chǎng)上占有重要地位,然而由病原真菌橢圓葡萄孢(Botrytis elliptica)和灰葡萄孢(B.cinerea)引起的灰霉病是百合生產(chǎn)中最主要的病害之一,前人從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化等方面,探討了百合對(duì)灰霉病的抗性機(jī)制。目前,有關(guān)百合響應(yīng)灰霉菌侵染的分子機(jī)制研究相對(duì)薄弱,本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上探索了百合對(duì)灰霉菌脅迫的早期應(yīng)答反應(yīng),挖掘了不同抗病反應(yīng)通路中重要候選基因,重點(diǎn)對(duì)岷江百合LrWRKYs基因家族成員進(jìn)行了序列進(jìn)化、轉(zhuǎn)錄表達(dá)及功能驗(yàn)證研究,確定了具有抗灰霉病作用的LrWRKYs成員。主要研究結(jié)果如下:(1)選取對(duì)灰霉病高抗的岷江百合為試驗(yàn)材料,對(duì)接種B.elliptica Oh、4h、12 h、24h后的葉片組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得96,416條高質(zhì)量的Unigene序列,其中47,719條(49.50%)Unigene獲得了功能注釋。四個(gè)樣本的表達(dá)譜共獲得了7,697個(gè)差異表達(dá)基因。與Oh相比,接種4h、12h及24h后均上調(diào)表達(dá)的基因有3,599個(gè),下調(diào)表達(dá)的基因有2,261個(gè)。接種12h后產(chǎn)生的差異表達(dá)基因數(shù)量最多,并且上調(diào)表達(dá)基因數(shù)目大于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目。共鑒定出了42個(gè)抗灰霉病相關(guān)基因,部分基因參與Ca2+信號(hào)通路、ROS產(chǎn)生及清除系統(tǒng)、苯丙烷生物合成通路、JA生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,另有部分基因編碼類受體激酶(RLKs)、多酚氧化酶(PPO)以及不同轉(zhuǎn)錄因子(WRKY、MYB、NAC、ERF)和PR蛋白,大多數(shù)基因在接種4h后便出現(xiàn)表達(dá)量的顯著增加。(2)檢索岷江百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),共獲得了 23個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)域的LrWRKYs基因家族成員,這些基因可劃分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ類,其中Ⅰ類WRKY蛋白成員具有2個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型(C-X4-C-X23-H-X1-H)鋅指結(jié)構(gòu)。Ⅱ類成員含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型(C-X4-5-C-X23-H-X1-H)鋅指結(jié)構(gòu)。Ⅲ類成員含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)鋅指結(jié)構(gòu),同類LrWRKYs基因大致具有相類似的基序組成,多數(shù)成員的結(jié)構(gòu)域含有保守的WRKYGQK序列,但LrWRKY6和LrWRKY7包含突變的WRKYGKK序列,分析LrWRKYs基因的功能注釋發(fā)現(xiàn)它們可能參與生物和非生物脅迫響應(yīng)。(3)在轉(zhuǎn)錄組中鑒定出6個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的Lr WRKYs基因,包括Ⅰ類成員LrWRKY8和LrWRKY10,Ⅱa類的LrWRKY12,Ⅱc類的LrWRKY4、LrWRKY6和LrWRKY7。在岷江百合和感病材料'Yale'中這6個(gè)基因能夠?qū).elliptica迅速做出響應(yīng),侵染12h或24h后便可高表達(dá);而這些基因在兩種百合中對(duì)B.cinerea的反應(yīng)相對(duì)滯后,侵染36h后才出現(xiàn)出表達(dá)量的顯著增加。一些LrWRKYs基因表達(dá)量的高低同百合對(duì)灰霉病的抗性水平具有明顯的相關(guān)性。Lr WRKY4和LrWRKY10在兩種灰霉菌分別侵染下的岷江百合中表達(dá)量均高于'Yale',而LrWRKY7則在兩種灰霉菌侵染下的'Yale'中有較高表達(dá)。Lr WRKY6、LrWRKY8和LrWRKY12只在一種灰霉菌(B.elliptica或B.cinerea)侵染下的岷江百合中高表達(dá)。預(yù)測(cè)岷江百合中高表達(dá)的LrWRKY4、LrWRYY6、Lr WRKY8、LrWRKYl0和LrWRKY12在百合抗灰霉病中發(fā)揮積極作用。(4)從岷江百合中克隆得到Ⅱc類成員LrWRKY4和Ⅱa類成員LrWRKY12,亞細(xì)胞定位分析表明二者為核定位蛋白,并且這兩個(gè)基因在岷江百合根、莖、葉和花中均有表達(dá),但在根中表達(dá)量最高;外施SA和MeJA可促進(jìn)它們的表達(dá)。在擬南芥中過表達(dá)Lr WRKY4可通過激活JA途徑防御基因(AtLOX、AtMYC2和AtPDF1.2)的表達(dá)并抑制SA途徑基因(AtPR1、AtPR2和AtPR5)的表達(dá)來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)B.cinerea的抗性,而LrWRKY12可同時(shí)增強(qiáng)SA和JA途徑防御基因的表達(dá)以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性,對(duì)比發(fā)現(xiàn)Lr WRKY4對(duì)抗性的增強(qiáng)效果更加顯著,是灰霉病抗性反應(yīng)中的重要促進(jìn)因子。(5)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的'回歸'百合組培苗鱗片的遺傳轉(zhuǎn)化體系。MS+0.1mg.L-1 KT+O.1mg·L-1 NAA+30g-L-1蔗糖是鱗片較好的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MS+0.2mg.L-1 NAA+0.005mg·L-1 TDZ+30g·L-1 蔗糖和 MS+2.Omg·L-1 PIC+1.0mg-L-1 KT+1.Omg·L-1 ZT+30g·L-1蔗糖分別是組培苗鱗莖薄層切片較好的不定芽和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。草丁膦濃度為0.8mg-L-1和0.4mg·L-1可分別作為鱗片和薄層切片在遺傳轉(zhuǎn)化中的篩選濃度。分別以組培苗小鱗片和鱗莖薄層切片為受體材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化LrWRKY4,結(jié)果顯示以鱗片為受體材料效果較好,轉(zhuǎn)化效率為2.08%;而薄層切片轉(zhuǎn)化效率較低,并未獲得轉(zhuǎn)基因植株,不適合做'回歸'轉(zhuǎn)化的受體材料。通過鱗片分化獲得的部分轉(zhuǎn)基因株系對(duì)B.elliptica的抗性顯著增強(qiáng)。以上研究結(jié)果對(duì)闡釋岷江百合抗灰霉病的分子機(jī)理具有重要的理論意義,獲得的'回歸'轉(zhuǎn)基因植株的獲得對(duì)培育高抗性百合新品種具有重要的作用。
【學(xué)位單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.8
【部分圖文】：

岷江百合響應(yīng)灰霉菌侵染的轉(zhuǎn)錄組分析及抗灰霉病相關(guān)基因的挖掘逡逑ＭＡＭＰｓ／ＰＡＭＰｓ），也包括因病原體侵染而產(chǎn)生的“自我”物質(zhì)（ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ逡逑ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ，邋ＤＡＭＰｓ），它們被植物默認(rèn)為危險(xiǎn)分子，由ＰＲＲ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)便逡逑是植物固有免疫？�。保�？１１１１５々也６代￡１丨１１１１１１１１１１辦，？�。保▓D卜１，步驟１）。緊接著病原體逡逑會(huì)進(jìn)一步向植物細(xì)胞內(nèi)釋放毒性效應(yīng)因子（ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）（步驟２），以此干擾ＰＴＩ（步驟３）。逡逑植物體內(nèi)的基因邐及）編碼的ＮＬＲ邋（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ，逡逑ＮＬＲ）類免疫受體蛋白，能夠以直接（步驟４ａ）或間接（步驟４ｂ－４ｃ）的方式特異性逡逑識(shí)別相應(yīng)的效應(yīng)因子，激活植物體內(nèi)的第二道防線，也就是效應(yīng)因子激發(fā)的免疫反應(yīng)逡逑（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ＥＴＩ）（步驟５），這一過程能夠引發(fā)超敏反應(yīng)，導(dǎo)致快速的逡逑植物細(xì)胞死亡或壞死，以此阻止病原菌進(jìn)一步入侵（Ｄａｎｇｌｅｔａｌ．，２０１３）。逡逑

ＷＲＫＹ成員進(jìn)行了重新分類，將Ｉ類依據(jù)Ｃ端結(jié)構(gòu)域的不同細(xì)分為ｌａ和Ｉｂ，將只在逡逑單子葉植物中存在的具有Ｃ２ＨＣ型鋅指結(jié)構(gòu)的成員歸為Ｉｃ；而ＩＩＩ類成員被分為了邋Ｉｌｉａ逡逑和Ｉｌｌｂ兩個(gè)亞類（圖１－２Ａ）。逡逑ＷＲＫＹ蛋白最初被認(rèn)為是高等植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，但隨后的研[偡⑾忠恍╁義顯鎦幸泊嬖詿死嘧家蜃櫻宜薔哂校衫喑稍鋇奶氐�，即含有两更x峁褂蚯義義閑恐附峁刮茫玻齲瞇停ǎ祝蹂澹澹翦澹幔歟玻埃埃擔(dān)�。Ｚｈａｎ＞i齲ǎ玻埃埃擔(dān)┰謚參鎦蟹治魴恐附峁刮義希茫玻齲殘偷模衫喑稍筆狽⑾鄭洌味私峁褂蠔停枚私峁褂蛟諛諍硬迦敕矯媧嬖誆鉅歟義賢撇舛嚦贍芾叢床煌�。另噎h(huán)矯媯桑衫嗪停桑桑衫喑稍敝淮嬖謨?cè)嵾等謪㈡y�，沁b桑桑衫噱義銑稍痹誚矯孀鍆懟⒆罨鈐盡Ｒ虼耍僑銜衫啵祝遙耍倩蚴親鈐緋魷值�，进辶x匣討型ü筆В味私峁褂蜓萇觶桑衫喑稍�，接着ＩＩ类成员讶O觶桑桑衫�，而单子辶x弦噸參錚桑桑衫喑稍蓖ü峁褂蚣穎兜姆絞

本文編號(hào)：2832384