番茄(Solanum lycopersium)是目前我國栽培面積最大的蔬菜之一,但是近年來各種病蟲害的發(fā)生嚴(yán)重影響了番茄作物的生長、產(chǎn)量及品質(zhì)。其中,由茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum,簡稱青枯菌)所引發(fā)的番茄青枯病的危害最為嚴(yán)重,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。青枯病是一種土傳病害,土壤中的溫度高、濕度大,易引起青枯病的發(fā)生。番茄是一種高需肥的作物,其主要從土壤中汲取生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì),在各種肥料中,氮肥的利用最為廣泛。氮肥會對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響,但是過施、偏施也會引起灰霉病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病等植物病害的發(fā)生。目前關(guān)于氮肥對于青枯病發(fā)生的影響尚不清楚,為此,本文以番茄為實驗材料,研究了不同氮肥對番茄青枯病發(fā)生的影響,所取得的結(jié)果如下:1、番茄青枯菌的鑒定、分離與保存為了得到對番茄具有強(qiáng)致病性的青枯菌菌種,通過培養(yǎng)基篩選出具有致病性的病原菌,接種野生型番茄植株后從莖部提取病原菌作為分離源,并用常規(guī)接種檢測的方法驗證其致病性強(qiáng)弱,將具有強(qiáng)致病性的番茄青枯菌進(jìn)行分離、保存,用于后續(xù)研究。2、根際不同氮肥處理對番茄青枯病發(fā)生的影響采用水培的栽培方式,對番茄施用7 mM NO3--N、7 mM Mix-N[NO3--N、NH4+-N(濃度比為7:3),下同]、1 mMNO3--N、1 mM Mix-N的氮肥營養(yǎng)液,番茄葉片中的NO3--N含量和硝酸還原酶(Nitrate reductase,NR)活性依次降低。對番茄植株的根部接種青枯菌R.solanacearum后,7 mM Mix-N處理的番茄植株發(fā)病最嚴(yán)重,1mM NO3--N處理的植株發(fā)病最輕,表明與7mM相比較,1mM濃度的氮肥可以減輕番茄青枯病的發(fā)病情況,同時,在相同濃度條件下,較高的NO3--N含量可以減輕番茄青枯病的發(fā)生。番茄根部氮代謝途徑起催化作用的關(guān)鍵酶硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthase,GS)、谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOG AT)所調(diào)控的基因NR、NiR1、NiR2、GS2、Fd-GOGAT的表達(dá)量表現(xiàn)出7 mM NO3--N高于7 mM Mix-N高于1 mM NO3--N高于1 mM Mix-N的變化趨勢。在接種青枯菌R.solanacearum后,病程相關(guān)蛋白路徑上的PR基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),激素水楊酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)的含量上升 50%。由此表明,高濃度的氮肥和銨態(tài)氮肥會加劇番茄青枯病的發(fā)生;根際不同氮肥處理通過影響氮代謝關(guān)鍵酶的活性來影響番茄植株對R.solanacearum的敏感性。3、氮代謝關(guān)鍵基因沉默對番茄青枯病發(fā)生的影響利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)技術(shù)構(gòu)建氮代謝關(guān)鍵基因沉默植株,并接種R.solanacearum后,TRV:NR、TRV:NiR12、TRV:GS2、TRV:Fd-GOGAT番茄植株的病情指數(shù)與TRV:0相比較下降25%-40%,發(fā)病癥狀減弱;根部抗病相關(guān)基因PR1、PR5的表達(dá)量顯著上調(diào),且在基因沉默植株中的上調(diào)倍數(shù)顯著高于TRV:0植株;接病后植株根部SA、JA的含量也顯著上調(diào),且在氮代謝關(guān)鍵基因沉默植株中SA的含量是TRV:0植株的1.5-2.25倍,而JA的含量則少于TRV:0。由此證明,將氮代謝關(guān)鍵基因沉默后,番茄植株對青枯病的抗性提高,并促進(jìn)抗病激素水楊酸SA的積累,但是其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.412.15
【部分圖文】：

而產(chǎn)生的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｓｙｓｔｅｍｉｃ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＳＲ）邋（Ｈｅｉｌ邋ａｎｄ邋Ｂａｌｄｗｉｎ，邋２００２）。逡逑水楊酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ邋ａｃｉｄ，邋ＳＡ）和茉莉酸（Ｊａｓｍｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ，邋ＪＡ）在植物防御病逡逑原菌入侵的過程中發(fā)揮著重要的作用，是植物體內(nèi)重要的信號分子（圖１．１）。ＳＡ逡逑是植物體內(nèi)的小分子酚類化合物，參與調(diào)節(jié)植物的許多生理生化過程，如種子萌逡逑發(fā)、細(xì)胞呼吸、氣孔關(guān)閉、膜通透、離子吸收以及植株衰老等，但ＳＡ最主要的逡逑作用之一是參與植物對病原菌的防御反應(yīng)（Ｈｕｂｂａｒｄ，邋２００２）�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，ＳＡ可以逡逑抑制病原菌分泌的植物細(xì)胞壁降解酶活性，能誘導(dǎo)多種植物對真菌、細(xì)菌及病毒逡逑病害產(chǎn)生抗性，從而減少病原菌對植物的危害，在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮著非常重逡逑要的誘導(dǎo)作用（Ｏｈａｓｈｉ邋ａｎｄ邋Ｍａｔｓｕｏｋａ，１９８７）。ＳＡ也是ＳＡＲ途徑的重要信號物質(zhì)，逡逑是植物受病原菌入侵后啟動一系列防衛(wèi)反應(yīng)的信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分。植逡逑物在病原菌入侵后可以通過ＳＡ的積累，激活自身的免疫機(jī)制。ＪＡ則主要參與逡逑死體營養(yǎng)型病原菌誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)

氮是植物生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)元素，其營養(yǎng)作用貫穿于植物的整個生命逡逑周期，被稱為植物的“生命元素”。氮是植物體內(nèi)許多代謝產(chǎn)物的重要組成成分，逡逑如蛋白質(zhì)、氨基酸、酶等（圖１．２），在植物的生命活動過程中具有重要的生理調(diào)逡逑節(jié)功能（張子義等，２００９；邋Ｉｎｏｋｕｃｈｉｅ／ａ／．邋，邋２０１０）。氮是植物營養(yǎng)生長過程中所需逡逑的大量元素，也是植物生理代謝過程中起催化作用的主要物質(zhì)。大多數(shù)植物主要逡逑通過吸收和利用土壤中可溶的有機(jī)氮化合物，如尿素和氨基酸等，以及無機(jī)態(tài)形逡逑態(tài)的氮來用于自身的營養(yǎng)生長（陶爽等，２０１７）。植物主要吸收的是硝態(tài)氮（ＮＣＶ－Ｎ）逡逑和銨態(tài)氮（ＮＦＵ＋－Ｎ），它們是植物整個生命過程中主要吸收的礦質(zhì)營養(yǎng)氮源（童學(xué)逡逑軍等，２００１）。不同形態(tài)的氮對植物生長與生理代謝過程的影響也不同，進(jìn)而對逡逑植物產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)（曹翠玲和李生秀，２００４）。逡逑Ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋Ｉ邋Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逡逑ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ邐１邋＂邋＂邋■邋．逡逑ｒ邋邐邐邋ｉ邋＾逡逑Ｓｕｇａｒｓ邋｜ｋ－邐＾邋Ｓｔａｒｃｈ逡逑Ｓｕｇａｒ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ邐Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ逡逑Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ＾－邐－｜邐＿邋ｗ邋＾ｆｔｒｏｍａｔｉｃ逡逑Ｌｉｐｉｄｓ邐ａｃｉｄｓ逡逑＾＾＾ＴＯｐｈｙｌｌ邐一－－’逡逑屓▲邐Ｍｒ逡逑Ａ邋Ｓｔｅｒｏｉｄｓ邐＿邋＿邐ｊ＾ｅｏｎｄａｒｙ逡逑Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄｓ邐ｂｏｌｉｔｅｓ逡逑★邋＾＼＾ＴＣＡ邋ｃｙｄｅｙ＾邐Ｎ—ｔｉｄｅｓ逡逑Ｐｕｒｉｎｅｓ邋Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ逡逑圖１．２植物氮代謝產(chǎn)物？（Ｋｕｓａｎｏ過ａ／．

邐番茄青枯菌的鑒定、分離與保存逡逑形狀不規(guī)則，流動性強(qiáng)（圖２．１ｂ）。已有的研究表明，非流動性菌株的致病性減逡逑弱或喪失，流動性強(qiáng)的菌株對寄主的致病力強(qiáng)，這種粘液狀物質(zhì)主要是菌株分泌逡逑的胞外多糖，是青枯菌重要的致病因子（韋中，２０１２）。因此，以圖２．１ｂ所示的番逡逑茄青枯菌為材料開展后面的實驗研究。逡逑ｍｍ邋－｜ｆｅ逡逑圖２．１無致病性（ａ）和致病性（ｂ）青枯菌在ＴＴＣ平板上的菌落形態(tài)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｖｉｒｕｌｅｎｔ邋ａｎｄ邋ａｖｉｒｕｌｅｎｔ邋Ｒ．邋ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ邋ｃｏｌｏｎｉｅｓ邋ｏｎ邋ＴＴＣ逡逑ｍｅｄｉｕｍ邋ｐｌａｔｅ逡逑２．２．２菌種的分離與保存逡逑用具有致病性的青枯菌菌株接種番廟植株后，從感病的番廟植株簽部提取病逡逑原菌作為分離源，用無菌水稀釋后點(diǎn)在固體擴(kuò)繁平板上，在２８邋°Ｃ恒溫箱中培養(yǎng)，逡逑形成兩種形態(tài)的單菌落。為便于標(biāo)記，將菌落顏色稍亮且多獨(dú)立存在的命名為Ｉ逡逑型番茄青枯菌，顏色較暗且集中分布的命名為ＩＩ型番茄青枯菌（圖２．２ａ）。將Ｉ逡逑型、ＩＩ型青枯菌分別用無菌水重懸形成ＯＤ６Ｇ（）＝１．０的菌液灌根接種野生型番茄植逡逑株以驗證致病性的強(qiáng)弱，結(jié)果如圖２．２ｂ所示，接種后的番茄植株與對照植株相逡逑比均明顯矮小

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