水稻白葉枯病是由水稻黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,簡(jiǎn)稱(chēng)Xoo)引起的世界水稻生產(chǎn)上嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一。微生物組在植物控制病原物侵染和定植中具有重要的功能,對(duì)植物內(nèi)生微生物種群的分析可揭示其在植物病害發(fā)生中的作用。然而,至今未見(jiàn)有關(guān)內(nèi)生微生物組與水稻白葉枯病發(fā)生之間關(guān)系的報(bào)道。因此,本研究采用16S rRNA和ITS測(cè)序法,比較分析了云南自然再生水稻病、健葉內(nèi)生細(xì)菌和真菌種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,與健葉相比,病葉內(nèi)變形菌門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度顯著增加,變形菌門(mén)泛菌屬和假單胞菌屬、放線(xiàn)菌門(mén)短小桿菌屬、腸桿菌科OTU_365和?-變形菌綱OTU_14豐度顯著上升。內(nèi)生真菌種群以子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為主。與健葉相比,病葉內(nèi)生子囊菌豐度顯著上升,而擔(dān)子菌顯著下降;豐度變化顯著真菌屬包括Khuskia、假皮司霉菌屬、小光殼屬、毛舌菌屬、短梗霉、枝孢菌屬、漆斑菌屬和Paraphaeosphaeria。從來(lái)源于云南和廣東病葉樣品中分離了30株內(nèi)生細(xì)菌菌株,其中9個(gè)泛菌菌株和1個(gè)假單胞菌株對(duì)Xoo具有明顯抑制作用。9個(gè)泛菌菌株16S rDNA序列也高度相似。其中MSMHa、MSMHe和MSZFNJa具有IAA合成、固氮和ACC脫氨酶活性等植物促生能力,表明它們可能具有水稻促生作用。將ZFZa、GDYCa和MSMHa分別與Xoo按照比例混合接種,發(fā)現(xiàn)水稻病斑長(zhǎng)度比單獨(dú)接種Xoo的顯著變短,表明這些菌株可能具有明顯的降害作用,是潛在的水稻白葉枯病害的生防因子。為明確我國(guó)南方稻區(qū)Xoo的生理小種組成、優(yōu)勢(shì)種群以及遺傳多樣性,本研究采用Xoo與IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24六個(gè)鑒別寄主的毒性互作反應(yīng)對(duì)南方5省(廣東、云南、廣西、浙江和湖北)稻區(qū)Xoo菌株的生理小種進(jìn)行了分析,同時(shí)以與Xoo致病性相關(guān)的avrBs3/pthA基因家族成員作為遺傳指標(biāo)的方法,使用tal4基因的SphⅠ片段為探針鑒定了這51個(gè)菌株的分子型。結(jié)果表明51個(gè)菌株可分為6個(gè)生理小種和10個(gè)分子型;6個(gè)生理小種包括R1、R8、R9、R17、R18和R19,其中R8占比高達(dá)78.43%、為優(yōu)勢(shì)生理小種,R17、R18和R19為新的生理小種;10個(gè)分子型可分為ClusterⅠ-Ⅳ4個(gè)簇群,ClusterⅣ占比最高為67.31%。另外,Xoo菌株生理小種與分子型之間無(wú)顯著對(duì)應(yīng)關(guān)系。綜上所述,本研究揭示了水稻白葉枯病健葉片內(nèi)生細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu),鑒定了內(nèi)生泛菌菌株的抑菌、促生以及降害作用。此外,明確了我國(guó)南方稻區(qū)水稻白葉枯病菌的生理小種組成以及遺傳結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)水稻內(nèi)生微生物組學(xué)、水稻白葉枯病害發(fā)生機(jī)制及其病害生防等進(jìn)行深入探究提供了科學(xué)依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S435.111.47
【部分圖文】：

%的甘油中備用。為鑒定病葉中各個(gè)分離物的分類(lèi)地位，Xoo 的鑒定使用引物 OGTTGTGAAAGCCCTG-3’和 OSR1:5’-CGGAGCTATATGCCGTGC-3’（闕海勇，2采用 16S rDNA 的通用引物 27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)(Morontabarrios et al., 2018) ，PCR 產(chǎn)物，序列經(jīng) NCBI BLAST 搜索最相似種，之后上傳至 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)268-MK578297。泛菌屬菌株生理生化性質(zhì)的測(cè)定定 9 個(gè) Pantoea sp.菌株的促生特性如生長(zhǎng)素 IAA 的產(chǎn)生、溶磷作用、ACC 脫氨用以及菌株的其他生理生化性質(zhì)如胞外多糖(EPS)的產(chǎn)生、運(yùn)動(dòng)性、胞外脂酶和性。具體步驟如下所示，全部實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。長(zhǎng)素 IAA 的產(chǎn)生：菌屬菌株接種到含有 1g/L 色氨酸的 LB 液體培養(yǎng)基中，28℃ 振蕩培養(yǎng) 3 天。取 0r/m ，離心 5min，取 200 L 上清液加到 96 孔板中 ，與 100 L salkowski’s 試置 30 分鐘，在波長(zhǎng) 530nm 下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。用不同濃度的 IAA 標(biāo)準(zhǔn)品（55, 1 , 0.5 ,0 mg/mL)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算 IAA 的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖：

MSMHa 與 PXO99A混合接種于水稻成株期葉片（每個(gè)處理始終保持 PXO99A的濃度為OD600=0.8），以單獨(dú)接種 PXO99A和單獨(dú)接種 ZFZa, GDYCa, MSMHa 為對(duì)照。14 天過(guò)后，觀(guān)察并記錄葉片病斑的長(zhǎng)度。2.3 結(jié)果與分析2.3.1 樣品的癥狀及病原物的檢測(cè)為了揭示健康水稻葉片(healthy)和水稻白葉枯病葉(BB)的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)，采集了九個(gè)不同的水稻品種的健康和發(fā)病的葉片包括兩個(gè)對(duì) Xoo 感病的品種，兩個(gè)攜帶抗性基因的品種以及五個(gè)云南當(dāng)?shù)氐钠贩N。圖 2-1 A 顯示了采集樣品時(shí)九個(gè)水稻品種白葉枯病發(fā)病的癥狀，可以看到明顯的沿葉脈擴(kuò)展的灰白色的病斑。之后將樣品進(jìn)行平板分離實(shí)驗(yàn)，可以分離到到明顯的黃色菌落如圖 2-1B，并且利用水稻白葉枯病菌的特異引物對(duì) OSF1/OSR1 進(jìn)行 PCR 鑒定，以水稻白葉枯病菌的菌株 PXO99A為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示病葉(A-I)B 中均存在水稻白葉枯病菌（圖 2-1 B 和 C）。健康的樣品(A-I)H 未觀(guān)察到明顯的水稻白葉枯病癥狀。水稻健康葉片和病葉的相應(yīng)部位（圖 2-1A中黑色框框所選部位）用于后續(xù)的 16 sRNAgene 和 ITS 分析。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 水稻健康葉片和白葉枯病葉內(nèi)生微生物群落分析2.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)總體分析測(cè)序一共得到 16S rDNA V4-V5 區(qū)高質(zhì)量序列 4,223,941 條，按照 97%的閾值將其歸入 855個(gè) OTUs，每個(gè)樣品平均含有 78,221 ±5691 序列。這些中有 18 個(gè) OTUs(2,776,979)被分配到水稻的葉綠體；6 個(gè) OTUs(378,037)分配到水稻的線(xiàn)粒體。葉綠體和線(xiàn)粒體的 OTUs 在計(jì)算相對(duì)豐度時(shí)保留，但在考慮內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)時(shí)去除。對(duì)于內(nèi)生真菌群落，一共得到了高質(zhì)量 ITS1 序列3,814,684 條，每個(gè)樣品平均含有 70642 ±14,949 條序列，這些序列被歸入了 1408 個(gè) OTUs（每個(gè)樣品平均含有 226 ±114 個(gè) OTUs）。稀釋曲線(xiàn)結(jié)果表明測(cè)序深度在 61415 reads，各個(gè)樣品內(nèi)生細(xì)菌群落的可觀(guān)測(cè)物種值已達(dá)到飽和（圖 2-2 A），而內(nèi)生真菌群落在 25549 reads 時(shí)達(dá)到飽和（圖2-2 B），表明測(cè)序深度已足夠，已基本涵蓋了樣品中所有的細(xì)菌與真菌。

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本文編號(hào)：2831037