小麥藍矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)是發(fā)生在我國西北地區(qū)冬小麥上的植原體病害。早在上世紀50年代,該病害首次在陜西報道,之后擴展到甘肅,寧夏和山西等地。小麥藍矮病是由小麥藍矮植原體侵染引起的病害,由介體昆蟲異沙葉蟬(Psammotettix alienus L.)傳播,近些年由于麥草覆蓋技術的推廣,使得介體昆蟲越冬基數增加,該病害逐漸擴展到黃河中下游干旱區(qū),給小麥生產帶來嚴重損失。本實驗室采用Solexa DNA測序方法完成了小麥藍矮植原體的基因組圖譜,對預測的37個分泌蛋白進行了抑制子的篩選和致病性分析,篩選到SWP6蛋白可以抑制BAX引起的本氏煙細胞過敏性壞死反應。然而,SWP6蛋白的功能及作用機理尚未明確,本論文針對小麥藍矮植原體SWP6蛋白開展了關鍵功能域鑒定,轉錄組測序以及亞細胞定位等一系列試驗,旨在能夠明確SWP6蛋白的功能,取得以下試驗結果:1.對SWP6蛋白的同源性、理化性質和空間結構等進行了分析預測。明確了SWP6基因全長618 bp,編碼206個氨基酸,編碼蛋白分子量大小約為23.8 kDa,等電點pI為6.98,多肽原子組成為C_(1063)H_(1721)N_(269)O_(315)S_(11),疏水性系數為0.120,屬于疏水性蛋白。其信號肽切割位點在蛋白N端第30-31個氨基酸,分泌到胞外成熟的分泌蛋白有174個氨基酸,分子量大小約為19.6 kDa。SWP6蛋白包含所有常見的20種氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,比例為13.6%。在第10-30個氨基酸之間存在跨膜區(qū)域,二級結構預測SWP6蛋白有3個α螺旋和多個無規(guī)則卷曲結構。2.以SWP6的生物信息學分析預測為基礎,構建了SWP6的5個功能域缺失突變體。分別命名為pGR107-SWP6DH1、pGR107-SWP6DH2、pGR107-SWP6DH3、pGR107-SWP6DH4、pGR107S-WP6DH5。利用農桿菌介導的外源基因在本氏煙中的瞬時表達技術,在本氏煙中分別瞬時表達5個缺失突變體,通過觀察本氏煙葉片癥狀和對接種葉RT-PCR的檢測,明確了SWP6蛋白中第84-113個氨基酸對其行使功能發(fā)揮了關鍵作用。以pCAMBIA1302為骨架載體構建了SWP6和eGFP融合的亞細胞定位表達載體,通過農桿菌介導外源基因在本氏煙中瞬時表達SWP6和eGFP的融合蛋白,確定了SWP6定位在本氏煙細胞膜中。3.通過對SWP6瞬時表達的本氏煙轉錄組測序結果的初步分析,篩選到差異表達基因有1093個,其中,上調表達基因540個,下調表達基因553個。挑選4個上調和4個下調關鍵基因進行了qRT-PCR驗證,結果表明這些基因差異表達倍數均與測序結果相吻合,為后續(xù)SWP6功能的進一步驗證提供基礎。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S435.12
【部分圖文】：

圖 1-1 健康長春花和 WBD 植原體感染長春花Fig.1-1 The heathy Periwinkle and wheat blue dwarf phytoplasma disease in Periwinkle2 小麥藍矮植原體病原學特征與傳播介體早年，小麥藍矮病經常發(fā)生在寒冷天氣條件下的霜凍或施氮肥較多的土壤麥田。染病害后的顯癥時間會比較快，所以人們認為小麥藍矮病是與天氣有關的生理病三等（1984）報道了小麥藍矮病害的發(fā)生、表現癥狀與傳播媒介，發(fā)現異沙葉蟬藍矮病專性傳播介體昆蟲，并且初步研究了異沙葉蟬的生物學傳毒特性，但此時小麥藍矮病是病毒引起的。安德榮等（1991）通過對小麥藍矮病組織學分析和電，并且用四環(huán)素等抗生素對發(fā)病小麥進行處理，結果表明小麥被四環(huán)素處理對其有明顯抑制作用，綜合分析說明類菌原體是小麥藍矮病發(fā)病的病原物。張秦風93）根據病原菌，寄主和介體及四環(huán)素對病株的敏感性，確定了小麥藍矮病屬于病害，這也是我國發(fā)現的首例小麥植原體病害。顧沛雯等（2005）采用巢式 PC帶病小麥 DNA，從分子水平證明藍矮病是植原體病害。3 小麥藍矮植原體寄主范圍與發(fā)生規(guī)律張秦風等（1992）和相建業(yè)等（1994）在陜西省楊凌區(qū)、渭南市、寶雞市等地調

2.1 試驗方法2.1.1 SWP6 氨基酸序列同源性分析在生物信息中心 NCBI 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載 SWP6 基因編碼的氨基酸序列，利用 NCBI 的在線工具 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對氨基酸序列進行同源性的比對分析。2.1.2 SWP6 蛋白理化特性的分析利用 Expasy 網站在線提供的軟件（http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam）進行蛋白基本特性的分析；利用 PSIPRED 軟件（http://brylinski.cct.lsu.edu/content/psipred）預測蛋白質二級結構；利用 swiss-model 軟件（http://swiss-model.expasy.org/）進行同源建模的三級結構的分析；利用 signalP 軟件對蛋白質的信號肽序列進行分析預測；利用在線軟件 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質進行跨膜區(qū)預測；利用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進行親水性預測。2.1.3 SWP6 基因及其氨基酸序列

圖 2-2 SWP6 蛋白信號肽切割位點預測（Hidden Markov models）Fig.2-2 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Hidden Markov models）圖 2-3 SWP6 蛋白信號肽切割位點預測（Neural networks）Fig.2-3 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Neural networks）

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王江飛;柳樹賓;吳蓓蕾;謝家建;王錫鋒;;陜西韓城嚴重發(fā)生的小麥矮縮病病原鑒定與原因分析[J];植物保護;2008年02期

2 楊鳳萍;王宏芝;陳緒清;張立全;張曉東;;利用病毒載體在煙草中瞬時表達融合HBsAg基因[J];西北植物學報;2008年02期

3 顧沛雯;吳云鋒;武科科;郝興安;;介體條沙葉蟬傳播小麥藍矮病植原體特性研究[J];植物保護;2007年04期

4 安鳳秋;吳云鋒;孫秀芹;顧沛雯;楊英;;小麥藍矮病植原體延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列的同源性分析[J];中國農業(yè)科學;2006年01期

5 吳云鋒,顧沛雯,安鳳秋,相建業(yè),羅朝鵬,楊英;小麥藍矮病植原體的寄主范圍研究[J];西北農林科技大學學報(自然科學版);2005年S1期

6 柳樹斌;劉金虎;劉金幫;高玉潔;吳云鋒;;韓城市小麥藍矮病發(fā)病條件及防治措施研究[J];陜西農業(yè)科學;2005年06期

7 張榮,孫廣宇,張雅梅,康振生;小麥藍矮病植原體16S rDNA序列分析研究[J];植物病理學報;2005年05期

8 顧沛雯,安鳳秋,吳云鋒,楊棟,羅朝鵬,相建業(yè),楊英;小麥藍矮病植原體16S rDNA基因片段的比較分析[J];植物病理學報;2005年05期

9 廖曉蘭,朱水芳,陳紅運,黃文勝,羅寬,趙文軍,馬榮群,朱建裕;植原體TaqMan探針實時熒光PCR檢測鑒定方法的建立[J];植物病理學報;2002年04期

10 彭燕,崔曉峰,周雪平;植物病毒—新型的外源基因表達載體[J];浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版);2002年04期

相關博士學位論文 前5條

1 李艷;長春花與小麥藍矮植原體互作過程中抗病相關基因的分離與分析[D];西北農林科技大學;2015年

2 陳旺;小麥藍矮植原體基因組序列測定及其分泌蛋白功能研究[D];西北農林科技大學;2015年

3 湯春蕾;條銹菌與小麥互作中效應蛋白及誘導寄主細胞壞死基因的鑒定與功能分析[D];西北農林科技大學;2013年

4 吳蓓蕾;小麥矮縮病毒分子群體遺傳結構與RNAi介導的抗BYDV-GAV轉基因小麥研究[D];中國農業(yè)科學院;2007年

5 顧沛雯;小麥藍矮病植原體的鑒定及其免疫膜蛋白（Imp）基因分子特性研究[D];西北農林科技大學;2007年

本文編號：2821387