百合是世界上集觀賞、食用為一體的重要園藝作物,植物學(xué)分類上屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)。為滿足對百合的巨大需求,中國主要從荷蘭引進(jìn)了大量的百合鱗莖繁殖材料。帶毒鱗莖的引進(jìn)致使百合病毒在中國傳播、蔓延。病毒是百合產(chǎn)量提升的重要限制因素。在中國,百合上的病毒主要有百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)、百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)。最近,一種新的感染百合的車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus,PlAMV)被鑒定,該病毒屬于甲型線形病毒科(Alphafilexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus),在美國、匈牙利、荷蘭、哥斯達(dá)黎加、智利、西班牙、英國、意大利、日本、韓國、俄國和中國均有報(bào)道。本研究的主要目的是通過高通量測序(Nextgeneration sequencing,NGS)鑒定百合植物中PlAMV,分析其分子特性,利用RT-PCR和RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。首先,建立3個百合樣品的混合池進(jìn)行高通量測序。測得reads序列用Trinity軟件拼接成較長的contig片段,使用NCBI在線分析工具BLASTN進(jìn)行contig序列的比對分析�；谛蛄斜葘Y(jié)果,設(shè)計(jì)2對引物擴(kuò)增百合樣品中PlAMV的全基因組序列。同時,從北京、云南和遼寧采集百合樣品共計(jì)40份,提取總RNA,RT-PCR和RT-qPCR方法檢測PlAMV的侵染情況,統(tǒng)計(jì)發(fā)生率。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序,使用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。NGS測序拼接后獲得一個長度為6174 nt的contig,與GenBank數(shù)據(jù)中的登陸的PlAMV分離物序列一致性為78%to 99%。之后,以RT-PCR結(jié)合5'和3'RACE方法從百合‘Siberia’中獲得PlAMV的全長基因組,該P(yáng)lAMV-Siberia分離物全長6101 nt。與Potexvirus相似,PlAMV-Siberia包含5個開放閱讀框,分別編碼156 kDa(ORF1)、25 kDa(ORF2)、12 kDa(ORF3)、13 kDa(ORF4)和12 kDa(ORF5)大小的蛋白。PlAMV-Siberia全基因組與GenBank數(shù)據(jù)中的登陸的PlAMV分離物核酸序列一致性為78%to 99%,編碼區(qū)氨基酸序列一致性為49-99%。研究構(gòu)建了基于ORF1(RdRP)和OFR5(CP)的系統(tǒng)發(fā)育樹,表明PlAMV-Siberia與PlAMV-Concador分離物關(guān)系較近。基于Potexviruses病毒屬全基因組的進(jìn)化發(fā)育分析結(jié)果表明,PlAMV-Siberia與郁金`香X病毒(Tulip virus X,TVX)聚在一起。最后,本研究設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針,建立了一步RT-qPCR檢測體系,用于快速診斷百合樣品中的PlAMV。對已知濃度的總RNA,進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋,即從10~(10)到10~1,制作了RT-qPCR的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究比較了傳統(tǒng)RT-PCR和一步RT-qPCR方法對百合樣品中PlAMV的檢測特異性、靈敏性和適用性,發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法結(jié)果基本一致。使用RT-qPCR檢測了來自于北京的40個百合樣品,僅5個樣品顯示PlAMV陽性,檢出率為12.5%。相較于傳統(tǒng)RT-PCR方法,RT-qPCR操作簡單、快速、可靠性高,能夠用于對百合中PlAMV的常規(guī)檢測。本研究首次建立了百合樣品中PlAMV的TaqMan探針一步RT-qPCR檢測方法。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.8

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本文編號：2819037