殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,Cry)是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)最重要的殺蟲活性成分。分離鑒定害蟲體內(nèi)可識(shí)別Cry毒素的結(jié)合蛋白,借以探究Cry殺蟲作用的分子過程,從根本上尋求解決Cry發(fā)展受限困境的新思路和新線索,成為Bt研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。本研究利用Pull-down結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),從甜菜夜蛾血淋巴中分離鑒定出Cry1Ab1的非受體結(jié)合蛋白昆蟲儲(chǔ)存蛋白(Storage protein,SP)、Cry7Ab4的非受體結(jié)合蛋白β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)、微管蛋白(Tubulin)、延伸因子1-α(Elongation factor 1-alpha)、昆蟲脫脂載脂蛋白(Apolipophorin)等。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室此前發(fā)現(xiàn)的新Cry基因——Cry2Ab12,構(gòu)建并表達(dá)純化Cry2Ab12毒素。同樣利用Pull-down結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),從小菜蛾中腸液中分離鑒定出Cry7Ab4的非受體結(jié)合蛋白富蛋氨酸儲(chǔ)存蛋白(Methionine-rich storage protien)、昆蟲脫脂載脂蛋白、脂肪酶1(Lipase-1)、熱休克蛋白70(Heat shock protein 70)等,以及Cry2Ab12的非受體結(jié)合蛋白芳基儲(chǔ)存蛋白(Arylphorin)、富蛋氨酸儲(chǔ)存蛋白、昆蟲脫脂載脂蛋白、一類過氧化物酶(peroxiredoxin)等,并對(duì)這些結(jié)合蛋白與Cry殺小菜蛾的相關(guān)性進(jìn)行了探討。本研究在大腸桿菌中表達(dá)了甜菜夜蛾儲(chǔ)存蛋白(SeSP),隨后解析了Cry1Ab1與SeSP之間的互作界面,探討了SeSP在Cry1Ab1殺甜菜夜蛾過程中的作用:(1)Cry1Ab1結(jié)合在SeSP六聚體結(jié)合位點(diǎn),令其無(wú)法形成六聚體,因此無(wú)法在血淋巴中穩(wěn)定存在,影響昆蟲體內(nèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存,進(jìn)而對(duì)昆蟲表皮形成、發(fā)育變態(tài)都將產(chǎn)生不可逆負(fù)作用,最終導(dǎo)致蟲體死亡;(2)Cry1Ab1與SeSP的三個(gè)結(jié)構(gòu)域均有結(jié)合,因此,二者的結(jié)合使SeSP無(wú)法發(fā)揮作用,降低了甜菜夜蛾體內(nèi)酚氧化酶的活性,從而起到殺蟲效果。此外,本研究還探討了β-1,3-葡聚糖酶和脫脂載脂蛋白等非受體結(jié)合蛋白與Cry7Ab4殺甜菜夜蛾作用的相關(guān)性。最后,本研究提出了血淋巴結(jié)合蛋白介導(dǎo)的Cry殺鱗翅目害蟲作用假說模型。本實(shí)驗(yàn)室前期利用Pull-down結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),已從小菜蛾和甜菜夜蛾中腸液中,分別鑒定出Cry1Ab1的非受體結(jié)合蛋白Dorsal和POXC。本研究以純化了的Dorsal與Cry1Ab1為對(duì)象,采用生物膜層干涉技術(shù),對(duì)二者之間的互作進(jìn)行了定性和定量研究,發(fā)現(xiàn)二者以1:1發(fā)生著較強(qiáng)結(jié)合,其KD值為3.96×10~(-9)M。經(jīng)分子對(duì)接分析,解析了二者互作的界面,據(jù)此合成了6條短肽,采用生物膜層干涉技術(shù)考察其互作,證實(shí)其中2條短肽可與小菜蛾Dorsal發(fā)生結(jié)合:NFDGSFRGSAQG、NSSVSII與Dorsal之間互作的KD值分別為8.68×10~-55 M和2.64×10~(-5)M,為Cry1Ab1與Dorsal結(jié)合過程中的關(guān)鍵肽段。這兩個(gè)肽段對(duì)應(yīng)在Dorsal蛋白上的結(jié)合區(qū)域?yàn)?1-87,該區(qū)域?qū)?yīng)的是參與修飾和核酸定位的p50Domain I,將影響Dorsal與特異κB序列進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)而影響AMP轉(zhuǎn)錄水平。此外,本研究還考察了Cry1Ab1與POXC的定性互作,二者以1:1發(fā)生互作。綜上所述,本研究分離鑒定了甜菜夜蛾血淋巴中的Cry1Ab1結(jié)合蛋白和Cry7Ab4結(jié)合蛋白,表達(dá)了Cry1Ab1血淋巴結(jié)合蛋白SeSP,考察了Cry與結(jié)合蛋白的體外互作,解析了Cry與結(jié)合蛋白的互作界面,鑒定了互作界面的關(guān)鍵肽段。這些研究結(jié)果,為揭開Cry殺蟲過程的全貌提供了新的思路和線索,為應(yīng)對(duì)抗性發(fā)展和提高殺蟲活性提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S476

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2816486