殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,Cry)是蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)最重要的殺蟲活性成分。分離鑒定害蟲體內(nèi)可識別Cry毒素的結合蛋白,借以探究Cry殺蟲作用的分子過程,從根本上尋求解決Cry發(fā)展受限困境的新思路和新線索,成為Bt研究的難點與熱點。本研究利用Pull-down結合LC-MS/MS技術,從甜菜夜蛾血淋巴中分離鑒定出Cry1Ab1的非受體結合蛋白昆蟲儲存蛋白(Storage protein,SP)、Cry7Ab4的非受體結合蛋白β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)、微管蛋白(Tubulin)、延伸因子1-α(Elongation factor 1-alpha)、昆蟲脫脂載脂蛋白(Apolipophorin)等。根據(jù)本實驗室此前發(fā)現(xiàn)的新Cry基因——Cry2Ab12,構建并表達純化Cry2Ab12毒素。同樣利用Pull-down結合LC-MS/MS技術,從小菜蛾中腸液中分離鑒定出Cry7Ab4的非受體結合蛋白富蛋氨酸儲存蛋白(Methionine-rich storage protien)、昆蟲脫脂載脂蛋白、脂肪酶1(Lipase-1)、熱休克蛋白70(Heat shock protein 70)等,以及Cry2Ab12的非受體結合蛋白芳基儲存蛋白(Arylphorin)、富蛋氨酸儲存蛋白、昆蟲脫脂載脂蛋白、一類過氧化物酶(peroxiredoxin)等,并對這些結合蛋白與Cry殺小菜蛾的相關性進行了探討。本研究在大腸桿菌中表達了甜菜夜蛾儲存蛋白(SeSP),隨后解析了Cry1Ab1與SeSP之間的互作界面,探討了SeSP在Cry1Ab1殺甜菜夜蛾過程中的作用:(1)Cry1Ab1結合在SeSP六聚體結合位點,令其無法形成六聚體,因此無法在血淋巴中穩(wěn)定存在,影響昆蟲體內(nèi)對營養(yǎng)物質(zhì)的儲存,進而對昆蟲表皮形成、發(fā)育變態(tài)都將產(chǎn)生不可逆負作用,最終導致蟲體死亡;(2)Cry1Ab1與SeSP的三個結構域均有結合,因此,二者的結合使SeSP無法發(fā)揮作用,降低了甜菜夜蛾體內(nèi)酚氧化酶的活性,從而起到殺蟲效果。此外,本研究還探討了β-1,3-葡聚糖酶和脫脂載脂蛋白等非受體結合蛋白與Cry7Ab4殺甜菜夜蛾作用的相關性。最后,本研究提出了血淋巴結合蛋白介導的Cry殺鱗翅目害蟲作用假說模型。本實驗室前期利用Pull-down結合LC-MS/MS技術,已從小菜蛾和甜菜夜蛾中腸液中,分別鑒定出Cry1Ab1的非受體結合蛋白Dorsal和POXC。本研究以純化了的Dorsal與Cry1Ab1為對象,采用生物膜層干涉技術,對二者之間的互作進行了定性和定量研究,發(fā)現(xiàn)二者以1:1發(fā)生著較強結合,其KD值為3.96×10~(-9)M。經(jīng)分子對接分析,解析了二者互作的界面,據(jù)此合成了6條短肽,采用生物膜層干涉技術考察其互作,證實其中2條短肽可與小菜蛾Dorsal發(fā)生結合:NFDGSFRGSAQG、NSSVSII與Dorsal之間互作的KD值分別為8.68×10~-55 M和2.64×10~(-5)M,為Cry1Ab1與Dorsal結合過程中的關鍵肽段。這兩個肽段對應在Dorsal蛋白上的結合區(qū)域為51-87,該區(qū)域?qū)氖菂⑴c修飾和核酸定位的p50Domain I,將影響Dorsal與特異κB序列進行結合,進而影響AMP轉(zhuǎn)錄水平。此外,本研究還考察了Cry1Ab1與POXC的定性互作,二者以1:1發(fā)生互作。綜上所述,本研究分離鑒定了甜菜夜蛾血淋巴中的Cry1Ab1結合蛋白和Cry7Ab4結合蛋白,表達了Cry1Ab1血淋巴結合蛋白SeSP,考察了Cry與結合蛋白的體外互作,解析了Cry與結合蛋白的互作界面,鑒定了互作界面的關鍵肽段。這些研究結果,為揭開Cry殺蟲過程的全貌提供了新的思路和線索,為應對抗性發(fā)展和提高殺蟲活性提供理論基礎。
【學位單位】：華僑大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S476

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊麗群;徐曼;崔紅娟;;家蠶(Bombyx mori)血細胞研究進展[J];蠶業(yè)科學;2015年06期

2 彭琦;周子珊;張杰;;蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白研究進展[J];中國生物防治學報;2015年05期

3 林珠鳳;謝圣華;吉訓聰;秦雙;;昆蟲貯存蛋白主要種類及功能研究進展[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學;2015年06期

4 關雄;蔡峻;;我國蘇云金桿菌研究60年[J];微生物學通報;2014年03期

5 羅婉冰;何文婧;黃玉秋;胡丹;黃立華;馮啟理;;斜紋夜蛾中腸糖代謝相關基因的克隆及表達模式分析[J];昆蟲學報;2013年09期

6 夏曉峰;林海蘭;鄭丹丹;楊廣;尤民生;;小菜蛾熱休克蛋白基因的鑒定及其表達模式分析[J];昆蟲學報;2013年05期

7 金盛凱;蔣亮;林平;孫薇;程廷才;夏慶友;;家蠶脂肪酶1(Bmlipase-1)的原核表達和抗體制備及在轉(zhuǎn)基因增量表達系統(tǒng)中的檢測[J];蠶業(yè)科學;2012年06期

8 閆碩;劉小俠;韓娜娜;倪慧;孫潔茹;張青文;;棉鈴蟲β-微管蛋白基因cDNA序列的克隆與序列分析[J];應用昆蟲學報;2012年01期

9 陳瑞瑞;崔金杰;李國清;;青霉素影響甜菜夜蛾幼蟲耐受幾種蘇云金桿菌晶體蛋白的能力[J];植物保護;2011年06期

10 閆碩;張t

本文編號：2816486