番茄白粉病是由新番茄粉孢菌(Oidium neolycopersici,On-Lz)引起的番茄生產(chǎn)上危害嚴重的一種真菌病害,但是番茄抗白粉病機制尚不完全清楚。真核生物中,信號轉(zhuǎn)換通常是由小G蛋白調(diào)控的,通過結(jié)合GTP的活化形式和結(jié)合GDP的非活化形式影響下游效應(yīng)因子進而調(diào)控多種信號傳導(dǎo)和代謝等過程。在小G蛋白中,來源于植物與Rho家族具有高度同源性的蛋白組成了植物特有的一類小GTP結(jié)合蛋白,即Rop家族。Rop家族的下游肌動蛋白相關(guān)蛋白ARP2/3復(fù)合體是肌動蛋白微絲骨架動力學(xué)的主要調(diào)控因子,與植物多種細胞學(xué)過程相關(guān),包括對生物脅迫的響應(yīng)。因此,研究小G蛋白ShROPs與微絲骨架聚合因子ShARPCs介導(dǎo)的植物免疫機制,對全面了解小G蛋白以及微絲骨架參與的免疫機制,以及進一步闡明番茄和白粉菌互作的分子機理具有重要意義。本研究以模式作物番茄和擬南芥作為主要研究對象,主要通過生物信息學(xué)、病毒誘導(dǎo)基因沉默、高效液相色譜、煙草瞬時過表達、擬南芥突變體回補、擬南芥過量表達、亞細胞定位、qRT-PCR、酵母雙雜交、酵母突變體回補等試驗方法,對小G蛋白ShROP1、ShROP11基因以及微絲骨架聚合因子ARP2/3復(fù)合體亞基ShARPC3、ShARPC5基因在番茄與白粉菌互作中的功能進行研究,并篩選與ShROP1、ShROP11互作的蛋白。主要研究結(jié)果如下:1.生物信息學(xué)分析表明小G蛋白ROP1的氨基酸序列具有高度保守性。ShROP1主要定位在細胞膜和細胞質(zhì)中。和番茄MM(Moneymaker)-白粉菌親和互作體系相比,非親和互作的番茄LA1777(Solanum habrochaites)在接種白粉菌后,ShROP1基因能夠顯著上調(diào)表達。在番茄LA1777植株上沉默ShROP1基因接種后,沉默植株的抗病性明顯降低。HPLC分析沉默株中的SA(Salicylic acid)激素含量顯著減少。組織學(xué)觀察表明番茄植株沉默ShROP1基因和擬南芥rop1突變體接種后均能減少寄主細胞過敏性壞死(HR)以及H_2O_2積累量。由此說明ShROP1可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生HR和H_2O_2抵抗病原菌侵入,且在煙草上瞬時過量表達能夠快速產(chǎn)生過敏性壞死,預(yù)示ShROP1可能介入了ETI防衛(wèi)反應(yīng)。也可以通過依賴內(nèi)源信號分子SA的傳遞途徑調(diào)節(jié)植物的抗病反應(yīng),從而激活下游抗病相關(guān)蛋白PR1和PR3基因的表達破壞病原菌的細胞結(jié)構(gòu)。2.番茄ShROP11主要定位在細胞膜和細胞核中。ROP11基因在番茄LA1777與白粉菌非親和互作中表達量顯著高于番茄MM與白粉菌親和互作。利用VIGS技術(shù)沉默ShROP11后,番茄LA1777對白粉菌On-Lz的抗性降低。和對照相比,沉默株接種后產(chǎn)生較少的HR和H_2O_2。HPLC分析沉默株中的脫落酸含量顯著升高。在擬南芥rop11突變體上異源過量表達ShROP11基因能夠恢復(fù)擬南芥的抗病性。由此說明ShROP11作為一個正調(diào)控因子參與番茄對生物脅迫的響應(yīng),通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生HR和H_2O_2來抑制病原真菌的侵入。此外,ShROP11可以通過依賴內(nèi)源信號分子ABA的傳遞途徑防御病原菌侵入,且抑制SA激素信號通路。3.利用酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)驗證ShROP1與ShProfilin、ShROP1與ShCHI9蛋白互作。ShROP1可能通過和Profilin蛋白互作調(diào)節(jié)下游肌動蛋白的聚合參與植物的PTI途徑。ShROP1也可以通過和ShCHI9蛋白互作通過破壞病原菌的細胞壁結(jié)構(gòu)從而抑制病原菌生長。并且證實ShROP11分別與ShCHI3和ShNP24蛋白互作。ShROP11通過與ShNP24蛋白互作調(diào)控抗病原菌物質(zhì)的產(chǎn)生,從而參與番茄抗病的PTI途徑。ShROP11也可以通過和ShCHI3蛋白互作通過破壞病原菌的細胞壁從而防御侵染。這些結(jié)果為ShROP1和ShROP11蛋白的免疫功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)依據(jù)。4.番茄LA1777植株上的ShARPC3基因編碼ARP2/3復(fù)合體的一個亞基蛋白。ShARPC3編碼的174個氨基酸的蛋白包含一個保守的P21-ARC結(jié)構(gòu)域。沉默ShARPC3能夠增加植物對番茄白粉病菌的感病性,說明了ShARPC3在植物防衛(wèi)信號中的作用,并且沉默ShARPC3導(dǎo)致SA介導(dǎo)的防衛(wèi)信號途徑受阻,同時SA信號分子下游的病程相關(guān)蛋白PR1、PR2和PR3基因表達顯著下調(diào)。相反,在擬南芥上異源過量表達ShARPC3后接種On-Lz,能夠通過誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏性壞死和活性氧增加植物的抗病性。此外,ShARPC3在釀酒酵母arc18突變體上異源表達能夠在溫度脅迫下回補生長表型�？傊�,ShARPC3在番茄上通過植物免疫的正向調(diào)節(jié)作用對On-Lz做出響應(yīng)。5.生物信息學(xué)分析表明番茄ARP2/3復(fù)合體亞基ShARPC5含有一個保守的P16-ARC結(jié)構(gòu)域,并且與擬南芥、煙草等親緣關(guān)系較近。VIGS試驗表明ShARPC5通過誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生ROS和HR響應(yīng)On-Lz生物脅迫,并且能誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白PR1基因的表達。相反,在擬南芥上異源過量表達ShARPC5能夠增加植株對On-Lz的抗病性。此外,ShARPC5也參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)。說明Arp2/3復(fù)合體在病原菌侵染過程中參與抗病作用。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.412.1


本文編號：2815393