蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在其芽胞形成階段產(chǎn)生的Cry毒素,是一類對多種農(nóng)林害蟲具有特異殺蟲活性的毒素蛋白。cry基因已被廣泛用于構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因作物,成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治鱗翅目、鞘翅目等Cry靶標(biāo)昆蟲的一種有效途徑。隨著這些轉(zhuǎn)基因作物種植面積日益增大,對Cry不敏感的蚜蟲占據(jù)了Cry靶標(biāo)昆蟲的原有生存空間,從次要害蟲逐漸升格為主要害蟲。目前控制蚜蟲主要采用化學(xué)法,這與擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因作物減少化學(xué)農(nóng)藥使用的目的背道而馳。因此,探究蚜蟲對Cry毒素蛋白不敏感的原因,揭示Cry抗蚜機(jī)理具有重要的理論意義與應(yīng)用前景。首先,本研究對不同Cry毒素的抗蚜活性進(jìn)行評價。在大腸桿菌中表達(dá)了不同的Cry毒素:Cry1Ab1、Cry2Ab12、Cry7Ab4、Cry-related(一種Cry41同源蛋白,迄今抗蚜活性最高的Cry蛋白)和SCAN2-2(Cry46同源蛋白),并構(gòu)建了cry2Ab12轉(zhuǎn)基因煙草、cry-related轉(zhuǎn)基因煙草、cry-related+Tma12雙價轉(zhuǎn)基因煙草(Tma12編碼一種蕨類植物來源的幾丁質(zhì)酶)。利用膜囊法和葉圓片法分別考察Cry毒素及轉(zhuǎn)基因煙草對桃蚜(Myzus persicae)的毒性水平,結(jié)果表明,Cry1Ab1蛋白對桃蚜基本沒有毒性,SCAN2-2對桃蚜顯示出較高的毒性,cry2Ab12轉(zhuǎn)基因煙草對桃蚜低毒,cry-related轉(zhuǎn)基因煙草及cry-related+Tma12雙價轉(zhuǎn)基因煙草均顯示出較高抗蚜活性。此外,降落在雙價轉(zhuǎn)基因植株上的有翅蚜,全部死亡且沒有發(fā)現(xiàn)其后代為害。其次,本研究采用Pull-down及LC-MS/MS技術(shù),從桃蚜全蟲勻漿上清中分離鑒定了Cry1Ab1、Cry7Ab4、Cry2Ab12、Cry-related、Cry1F及Vip3Aa的結(jié)合蛋白。結(jié)果表明,所有Cry毒素都存在與細(xì)胞吞噬相關(guān)的結(jié)合蛋白,這可能意味著Cry蛋白能夠通過胞吞作用進(jìn)入蚜蟲細(xì)胞;所有Cry毒素都沒有出現(xiàn)鈣粘蛋白(CAD)及堿性磷酸酶(ALP)之類的結(jié)合蛋白(CAD和ALP是鱗翅目昆蟲識別Cry的常見受體),這可能是Cry毒素對蚜蟲低毒的原因;桃蚜Cathepsin-B及桃蚜共生菌來源的ATP-dependent-6-phosphofructokinase是Cry-related獨(dú)有的結(jié)合蛋白,這可能是Cry-related抗蚜活性最高的原因。利用String數(shù)據(jù)庫,對結(jié)合蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測,結(jié)果顯示部分Cry作用于蚜蟲的分子過程涉及了MAPK、Hippo或Wnt通路。最后,本研究考察Cry-related與Cathepsin-B的體外互作,探討Cathepsin-B在Cry-related抗蚜過程中的作用。在大腸桿菌中克隆表達(dá)了桃蚜Cathepsin-B蛋白,利用免疫印跡分析法證實(shí)Cry-related與Cathepsin-B二者體外可直接互作,這進(jìn)一步表明Cry-related對蚜蟲毒性最強(qiáng)可能是通過其與Cathepsin-B的互作來實(shí)現(xiàn)的。本研究還測定了Cathepsin-B的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)它是一個典型的半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶在細(xì)胞凋亡中起著重要作用,Cry-related屬于能誘發(fā)細(xì)胞凋亡的抗癌晶體蛋白,所以,Cry-related與Cathepsin-B二者的互作,可能協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性凋亡。分子對接結(jié)果表明,Cry-related與Cathepsin-B的結(jié)合,封閉了Cathepsin-B的活性位點(diǎn),這表明Cry-related還可能影響到蚜蟲正常的蛋白降解,進(jìn)而影響了蚜蟲的生長發(fā)育。據(jù)此,本研究提出了Cry抗蚜機(jī)理假說:蚜蟲的CAD、ALP與其他昆蟲的存在顯著差異,導(dǎo)致多數(shù)Cry毒素?zé)o法與其常見受體發(fā)生結(jié)合,因此對蚜蟲不敏感,而Cry-related可以通過與Cathepsin-B的互作,誘發(fā)蚜蟲細(xì)胞發(fā)生惡性凋亡或是影響蛋白降解利用進(jìn)而發(fā)揮了抗蚜作用,Cry-related還可通過與共生菌來源的ATP-dependent-6-phosphofructokinase發(fā)生互作,影響蚜蟲的生長發(fā)育,從而起到抗蚜作用。本研究結(jié)果,可為如何提高Cry抗蚜活性提供理論基礎(chǔ),對應(yīng)用Cry有效防控蚜蟲為害具有重要意義。
【學(xué)位單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S433.3
【部分圖文】：

桃蚜Figure1.1Myzuspersicae

寄生蜂捕食蚜蟲Figure1.5Parasiticwaspspreyonaphids

表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜pET-Cry-relatedFigure2.1TheprofileofplasmidpET-Cry-related

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄧淑;束長龍;林毅;宋福平;張杰;;新型cry7Ab基因的鑒定、克隆、表達(dá)與殺蟲活性[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2009年05期

2 關(guān)雄;;蘇云金芽孢桿菌研究回顧與展望[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2006年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 溫?fù)P帆;害蟲體內(nèi)Cry結(jié)合蛋白的鑒定及其與Cry毒素的互作研究[D];華僑大學(xué);2018年

2 古宇清;小菜蛾及甜菜夜蛾中腸液中Cry結(jié)合蛋白的分離與鑒定[D];華僑大學(xué);2017年

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本文編號：2811443