發(fā)布時間：2020-09-02 12:00

　　 本文利用自主研發(fā)的抗病毒劑嘧肽霉素(Cytosinpeptidemycin,CytPM)與誘抗劑殼寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)復配得到了一種兼具預防、治療和誘抗等多種功能的新型抗病毒劑——嘧肽寡糖(Cytosinpeptidemycin-Chitosan oligosaccharide,CytPM-COS),同時研究了新型復配劑對TMV RNA和蛋白的影響,對寄主活性氧和葉綠素含量的影響,以及誘導寄主產(chǎn)生抗病相關基因的作用,主要研究結果如下:1.通過十種藥劑對TMV在系統(tǒng)寄主普通煙K326上的防效和在枯斑寄主心葉煙上的枯斑抑制率調查統(tǒng)計,篩選出了一種效果較好的藥劑殼寡糖。殼寡糖對普通煙K326上TMV的防治效果達42.10%,對TMV在心葉煙的枯斑抑制率達56.78%;將篩選出的殼寡糖與嘧肽霉素在本生煙、心葉煙和辣椒上分別篩選最適濃度范圍,并在最適濃度范圍內復配嘧肽寡糖;再以嘧肽寡糖處理以上三種寄主調查對TMV的防效和枯斑抑制率:對本生煙上TMV的防效為78.78%,對心葉煙上TMV的枯斑抑制率高達91.88%,對辣椒上TMV的防效達到58.24%,新復配的嘧肽寡糖對病毒病的防效均高于單劑嘧肽霉素和殼寡糖。2.利用新復配的嘧肽寡糖從直接作用于病毒和作用于寄主兩個方面進行抗病毒機制研究。對病毒作用機制方面,通過Northern blot檢測嘧肽寡糖對BY-2單細胞中TMV RNA正、負義鏈積累量的影響,發(fā)現(xiàn)嘧肽寡糖能夠有效抑制TMV RNA正、負義鏈的積累,從而抑制TMV在BY-2中的增殖。通過Western blot檢測在BY-2單細胞和本生煙植株兩個體系中TMV CP蛋白的積累量,發(fā)現(xiàn)經(jīng)嘧肽寡糖處理過的寄主中TMV CP積累量明顯減少;另外,本生煙在接種前后噴施兩次嘧肽寡糖對TMV CP的積累量抑制效果最顯著。構建TMV CP、TMV MP、TMV p126分別與GFP相連的載體,并將重組質粒導入農桿菌,浸潤本生煙,觀察嘧肽寡糖處理對TMV的三個蛋白CP、MP、p126在本生煙中定位的影響,發(fā)現(xiàn)接種對照中CP聚集在細胞壁上較多,在內質網(wǎng)上較少。經(jīng)嘧肽寡糖處理,CP聚集在內質網(wǎng)上較多,而結合在細胞壁的量減少,但嘧肽寡糖對TMV MP和TMV p126在細胞中的定位沒有明顯的影響。嘧肽寡糖可以誘導寄主產(chǎn)生抗病性,是其另一重要作用機制。嘧肽寡糖能夠誘導BY-2活性氧含量增加,在處理細胞3 h活性氧含量達到峰值,OD值(600nm)為0.264,是同時間對照OD值的2.06倍;接種TMV清水處理的K326葉綠素含量為0.285 mg/g,嘧肽寡糖處理下葉綠素含量為0.381 mg/g,被TMV侵染的普通煙K326在嘧肽寡糖處理下葉綠素含量增加。通過qPCR定量檢測抗病相關基因發(fā)現(xiàn),嘧肽寡糖處理下PR5、NPR1、HSP70、HSC70、MAPKKK、WRKY53、WRKY70七個基因均有所上調,其中HSP70上調了31.60倍,PR5上調了16.15倍,上調極顯著;NPR1、WRKY53分別上調了8.51倍、8.06倍,也顯著上調;表明嘧肽寡糖能夠誘導寄主產(chǎn)生抗病性。綜上,嘧肽寡糖能夠抑制TMV-RNA、TMV CP的積累,并且對TMV CP的定位產(chǎn)生影響,還能夠促使寄主植物活性氧和葉綠素含量增加,誘導寄主抗性相關基因表達量上調。3.嘧肽寡糖田間應用試驗表明,嘧肽寡糖對煙草病毒病的防效為40.17%~40.33%,顯著高于寧南霉素、嘧肽霉素、殼寡糖;嘧肽寡糖對辣椒病毒病防治效果最好,高達34.03%~37.03%,明顯優(yōu)于嘧肽霉素、殼寡糖;同樣,嘧肽寡糖對番茄病毒病的防效也達到34.53%~36.73%,高于嘧肽霉素、殼寡糖。綜上,表明嘧肽寡糖對煙草、辣椒和番茄病毒病具有良好的防治效果。
【學位單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S482.2
【部分圖文】：

圖 1-1 藥劑處理并接種 TMV 的心葉煙Fig 2-1. N. glutinosa inoculate TMV with pesticides清水處理接種 TMV，2 為 COS 50 μg/mL 處理并接種 TMV，3 為 COS 100 μg/mL 處理并接種 TMV，4/mL 處理并接種 TMV，5 為 CytPM 50μg/mL 處理并接種 TMV，6 為 CytPM 100 μg/mL 處理并接種 T寡糖處理并接種 TMV，8 為清水接種 PBS 緩沖液。2.2 嘧肽寡糖對系統(tǒng)寄主本生煙侵染 TMV 的作用效果嘧肽寡糖、嘧肽霉素和殼寡糖在接種 TMV 的本生煙上都具有抑制作用，且嘧防效高達 78.78%，顯著高于兩種單劑不同濃度的防效。表明復配劑嘧肽寡糖霉素、殼寡糖單劑，二者復配后具有增效作用。表 2-5. 藥劑對接種 TMV 的本生煙的防效Table 2-5. Control efficiency of pesticides on TMV at Nicotiana benthamiana處理病情指數(shù) 防效（%） 顯著性嘧肽寡糖 15.56 78.78 aCOS 50 μg/mL 28.89 60.60 bCOS 100 μg/mL 31.11 57.58 b

圖 3-1.藥劑處理的 BY-2 原生質體內 TMV RNA 積累量Figure 3-1. Accumulation of TMV RNA in BY-2 protoplast treated with pesticidesV 只接種 TMV 無藥劑處理；嘧肽寡糖為接種 TMV 并嘧肽霉素 25 μg/mL 與殼寡糖 12.5 μg/mL 處理；Mock 為不接種 TMV 且無劑處理；其余均為接種 TMV 并藥劑處理。 嘧肽寡糖對寄主內 TMV 外殼蛋白積累量的影響.1 嘧肽寡糖對 BY-2 原生質體中 TMV CP 積累量的影響B(tài)Y-2 原生質體接種 TMV 病毒粒子，并用藥劑處理 20 h，提取蛋白。經(jīng) Western b TMV CP 的結果顯示，在無藥劑處理情況下 TMV CP 在 20 h 較 4 h 積累量明顯表明 TMV 在 BY-2 原生質體中能夠正常進行復制增殖。三個藥劑對 TMV CP 的有不同程度的抑制作用，且在嘧肽寡糖處理下，TMV CP 積累量顯著少于只接 的積累量，嘧肽寡糖對 TMV CP 的抑制效果較單劑嘧肽霉素和殼寡糖抑制效果

圖 3-2. BY-2 原生質體內 TMV CP 積累量Figure 3-2. Accumulation of TMV CP in BY-2 protoplast treated with pesticideV 4 h 為接種 TMV 無藥劑 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 4 h；TMV 20 h 為接種 TMV 無藥劑 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 20 h；嘧肽霉素為接種肽霉素 25 μg/mL 的 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 20 h；殼寡糖為接種 TMV 并在含 12.5 μg/mL 的 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 20 h；嘧肽寡糖為接在含嘧肽霉素 25 μg/mL 與殼寡糖 12.5 μg/mL 的 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 20 h；Mock 為接種 PEG 并在無藥劑 W1 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 2.2 嘧肽寡糖對本生煙中 TMV CP 積累量的影響從圖 2-3 中可以看出接種 TMV 第 6 天，對照無藥劑處理接種 TMV 后出現(xiàn)嚴重皺縮、脫水、葉脈壞死的癥狀；處理 1 出現(xiàn)了輕微花葉現(xiàn)象；處理 2 出現(xiàn)花葉并且個別葉脈出現(xiàn)壞死跡象；處理 3 出現(xiàn)花葉和皺縮現(xiàn)象；Mock 無感病癥狀的，圖 3-4 Western blot 檢測結果顯示藥劑處理后 TMV CP 積累量均少于對照 3-3 本生煙的發(fā)病情況相符，處理 1 噴施兩次藥劑對 TMV 的抑制效果最佳，種前噴藥和處理 3 接種后噴藥對 TMV 具有一定的抑制效果，但抑制作用次于施兩次藥劑，Mock 中沒有檢測到 TMV。

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本文編號：2810565