【摘要】：蘋果樹腐爛病菌(Valsa mali)是一種死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌。該病菌造成的蘋果樹腐爛病給蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的損失。目前對(duì)蘋果樹腐爛病菌的研究雖然很多,但關(guān)鍵致病因子仍然不清晰。在分子水平研究蘋果樹腐爛病菌的致病機(jī)理,將為進(jìn)一步了解該病害提供理論依據(jù)。效應(yīng)蛋白在真菌致病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用�；谔O果樹腐爛病菌基因組測(cè)序的基礎(chǔ),從32個(gè)效應(yīng)基因中篩選得到細(xì)胞死亡抑制子VmPxE1并對(duì)其進(jìn)行功能研究和靶標(biāo)篩選主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.VmPxE1的鑒定與功能解析通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PVX瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)鑒定出蘋果樹腐爛病菌效應(yīng)蛋白VmPxE1可以抑制由Bax引起的細(xì)胞壞死;由酵母分泌系統(tǒng)驗(yàn)證蘋果樹腐爛病菌效應(yīng)蛋白VmPxE1的信號(hào)肽具有分泌功能;qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)基因VmPxE1在蘋果樹腐爛病菌侵染蘋果枝條的不同時(shí)期均上調(diào)表達(dá);進(jìn)一步對(duì)蘋果樹腐爛病菌VmPxE1進(jìn)行基因敲除,敲除后的突變體在PDA培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力與野生型相比并沒有差別,但是在蘋果“富士”枝條和葉片中致病力與野生型相比均顯著降低;對(duì)VmPxE1進(jìn)行基因回復(fù),回復(fù)突變體的致病力回復(fù)到野生型水,這些結(jié)果表明了VmPxE1在蘋果樹腐爛病菌的侵染過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。2.VmPxE1的靶標(biāo)鑒定利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選得到了一個(gè)候選靶標(biāo)蘋果的過(guò)氧化物酶MdAPX1,經(jīng)過(guò)全長(zhǎng)驗(yàn)證、雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)、免疫共沉淀(CO-IP)試驗(yàn)證均實(shí)效應(yīng)蛋白VmPxE1與MdAPX1是互作的;MdAPX1系統(tǒng)發(fā)育分析得知MdAPX1是一種L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶。本研究對(duì)效應(yīng)蛋白VmPxE1進(jìn)行了功能研究以及與寄主互作靶標(biāo)篩選等實(shí)驗(yàn),找到了一個(gè)互作靶標(biāo),為蘋果樹與蘋果樹腐爛病菌分子互作研究提供了重要的依據(jù),并且為以后的致病機(jī)制的解析奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.611.11
【圖文】：

圖 1-1 ZIGZAG 模型（JonesAnd Dangl Nature，2006）Fig. 1-1 ZIGZAG modle （Jones And Dangl Nature, 2006）1.2.2 效應(yīng)蛋白的定義為了成功侵染植物，病原菌分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主植物并破壞它們的免疫反應(yīng)。雖然效應(yīng)蛋白的統(tǒng)一定義仍然難以捉摸，但是已經(jīng)鑒定出越來(lái)越多具有典型效應(yīng)特征的微生物相關(guān)分子，例如小RNA和其他小分泌分子(Lo Presti et al. 2015; Rovenich et al2014; Wang et al. 2016)。狹義上而言，效應(yīng)蛋白就是被某些分泌的蛋白質(zhì)，通常被定義為含有不超過(guò)300個(gè)富含半胱氨酸殘基的氨基酸的小分子分泌蛋白質(zhì)，通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致病原菌進(jìn)一步在植物體內(nèi)侵染和定殖(Duplessis et al. 2011; Mulleret al. 2008; Stergiopoulos et al. 2012)。1.2.3 真菌效應(yīng)蛋白的研究真菌病原菌有不同的生活方式，包括死體營(yíng)養(yǎng)型(necrotrophic)、活體營(yíng)養(yǎng)型（biotrophic）和半活體營(yíng)養(yǎng)型（hemibiotrophic）（Hurley et al. 2014）。死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌通過(guò)快速殺死寄主細(xì)胞并在其內(nèi)容物上存活（Stone 2001）。番茄織球殼菌萎蔫

圖 2-1 敲除片段構(gòu)建示意圖Fig. 2-1 Gene replacement strategy for effector gene以Double-joint PCR法構(gòu)建敲除片段（圖2-1），參考Yu的方法(Yu et al. 2004），分為四步：（1）常規(guī)PCR體系擴(kuò)增neo片段及基因VmPxE1上下游片段：以質(zhì)粒PFL2作為模板使用引物Neo-F/R擴(kuò)增neo片段。同時(shí)將野生型03-8基因組DNA作為模板，使用1F/2R、3F/4R引物擴(kuò)增目標(biāo)基因的上游片段和下游片段，膠回收目標(biāo)條帶。（2）Double-joint PCR擴(kuò)增第一步：把上游片段與下游片段以及neo基因片段混合構(gòu)建融合片段。配制反應(yīng)體系如下：反應(yīng)成分 體積5×Buffer 5 μLdNTPs 4 μL上游片段 1 μL下游片段 1 μLneo 片段 3 μLFastpfu 酶 0.3 μLddH2O 補(bǔ)至 25 μLPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 5 min；98℃ 30 s；58℃ 4 min；72℃ 150 s；15個(gè)循環(huán)；72℃10 min；16℃，forever。（3）Double-joint PCR擴(kuò)增第二步：以（2）中PCR產(chǎn)物作為反應(yīng)模板，使用引物1F/4R擴(kuò)增敲除片段，PCR 體系如下：反應(yīng)成分 體積5×Buffer 5 μL1F/4R 0.4 μL/0.4 μL

2.3.1 VmPxE1 抑制 Bax 誘導(dǎo)的 PCD 反應(yīng)將已經(jīng)構(gòu)建到PVX載體上的32個(gè)基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101，注射到煙草內(nèi)，從而瞬時(shí)表達(dá)效應(yīng)基因。以eGFP為陰性對(duì)照，具體的注射方法如圖2-2A所示，在注射完eGFP和效應(yīng)基因后16 h時(shí)，再次在同一位置注射含有BAX的農(nóng)桿菌菌液。5天后觀察BAX誘導(dǎo)的PCD反應(yīng)，以明確候選基因是否具有抑制BAX誘導(dǎo)的PCD的功能。最終篩選得到一個(gè)能夠抑制BAX誘導(dǎo)的PCD。如圖所示注射含有BAX的農(nóng)桿菌菌液的位置，出現(xiàn)了壞死；注射eGFP不能引起壞死；VmPxE1不能引起細(xì)胞壞死，但是能抑制BAX誘導(dǎo)的PCD反應(yīng)，且抑制效率達(dá)到了92%（46/50）；接著由RT-PCR實(shí)驗(yàn)，以本氏煙基因GAPDH為內(nèi)參基因

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本文編號(hào)：2803904