【摘要】：蘋果樹腐爛病菌(Valsa mali)是一種死體營養(yǎng)型病原真菌。該病菌造成的蘋果樹腐爛病給蘋果的產量和品質造成了嚴重的損失。目前對蘋果樹腐爛病菌的研究雖然很多,但關鍵致病因子仍然不清晰。在分子水平研究蘋果樹腐爛病菌的致病機理,將為進一步了解該病害提供理論依據(jù)。效應蛋白在真菌致病過程中起著至關重要的作用。基于蘋果樹腐爛病菌基因組測序的基礎,從32個效應基因中篩選得到細胞死亡抑制子VmPxE1并對其進行功能研究和靶標篩選主要實驗結果如下:1.VmPxE1的鑒定與功能解析通過農桿菌介導的PVX瞬時表達系統(tǒng)鑒定出蘋果樹腐爛病菌效應蛋白VmPxE1可以抑制由Bax引起的細胞壞死;由酵母分泌系統(tǒng)驗證蘋果樹腐爛病菌效應蛋白VmPxE1的信號肽具有分泌功能;qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)基因VmPxE1在蘋果樹腐爛病菌侵染蘋果枝條的不同時期均上調表達;進一步對蘋果樹腐爛病菌VmPxE1進行基因敲除,敲除后的突變體在PDA培養(yǎng)基中的營養(yǎng)生長和產孢能力與野生型相比并沒有差別,但是在蘋果“富士”枝條和葉片中致病力與野生型相比均顯著降低;對VmPxE1進行基因回復,回復突變體的致病力回復到野生型水,這些結果表明了VmPxE1在蘋果樹腐爛病菌的侵染過程中起著至關重要的作用。2.VmPxE1的靶標鑒定利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選得到了一個候選靶標蘋果的過氧化物酶MdAPX1,經過全長驗證、雙分子熒光互補(BIFC)、免疫共沉淀(CO-IP)試驗證均實效應蛋白VmPxE1與MdAPX1是互作的;MdAPX1系統(tǒng)發(fā)育分析得知MdAPX1是一種L-抗壞血酸過氧化物酶。本研究對效應蛋白VmPxE1進行了功能研究以及與寄主互作靶標篩選等實驗,找到了一個互作靶標,為蘋果樹與蘋果樹腐爛病菌分子互作研究提供了重要的依據(jù),并且為以后的致病機制的解析奠定了理論基礎。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S436.611.11
【圖文】：

圖 1-1 ZIGZAG 模型（JonesAnd Dangl Nature，2006）Fig. 1-1 ZIGZAG modle （Jones And Dangl Nature, 2006）1.2.2 效應蛋白的定義為了成功侵染植物，病原菌分泌的效應蛋白進入寄主植物并破壞它們的免疫反應。雖然效應蛋白的統(tǒng)一定義仍然難以捉摸，但是已經鑒定出越來越多具有典型效應特征的微生物相關分子，例如小RNA和其他小分泌分子(Lo Presti et al. 2015; Rovenich et al2014; Wang et al. 2016)。狹義上而言，效應蛋白就是被某些分泌的蛋白質，通常被定義為含有不超過300個富含半胱氨酸殘基的氨基酸的小分子分泌蛋白質，通過二硫鍵穩(wěn)定其三級結構，可導致病原菌進一步在植物體內侵染和定殖(Duplessis et al. 2011; Mulleret al. 2008; Stergiopoulos et al. 2012)。1.2.3 真菌效應蛋白的研究真菌病原菌有不同的生活方式，包括死體營養(yǎng)型(necrotrophic)、活體營養(yǎng)型（biotrophic）和半活體營養(yǎng)型（hemibiotrophic）（Hurley et al. 2014）。死體營養(yǎng)型病原真菌通過快速殺死寄主細胞并在其內容物上存活（Stone 2001）。番茄織球殼菌萎蔫

圖 2-1 敲除片段構建示意圖Fig. 2-1 Gene replacement strategy for effector gene以Double-joint PCR法構建敲除片段（圖2-1），參考Yu的方法(Yu et al. 2004），分為四步：（1）常規(guī)PCR體系擴增neo片段及基因VmPxE1上下游片段：以質粒PFL2作為模板使用引物Neo-F/R擴增neo片段。同時將野生型03-8基因組DNA作為模板，使用1F/2R、3F/4R引物擴增目標基因的上游片段和下游片段，膠回收目標條帶。（2）Double-joint PCR擴增第一步：把上游片段與下游片段以及neo基因片段混合構建融合片段。配制反應體系如下：反應成分 體積5×Buffer 5 μLdNTPs 4 μL上游片段 1 μL下游片段 1 μLneo 片段 3 μLFastpfu 酶 0.3 μLddH2O 補至 25 μLPCR擴增程序為：98℃ 5 min；98℃ 30 s；58℃ 4 min；72℃ 150 s；15個循環(huán)；72℃10 min；16℃，forever。（3）Double-joint PCR擴增第二步：以（2）中PCR產物作為反應模板，使用引物1F/4R擴增敲除片段，PCR 體系如下：反應成分 體積5×Buffer 5 μL1F/4R 0.4 μL/0.4 μL

2.3.1 VmPxE1 抑制 Bax 誘導的 PCD 反應將已經構建到PVX載體上的32個基因的重組質粒轉化到農桿菌GV3101，注射到煙草內，從而瞬時表達效應基因。以eGFP為陰性對照，具體的注射方法如圖2-2A所示，在注射完eGFP和效應基因后16 h時，再次在同一位置注射含有BAX的農桿菌菌液。5天后觀察BAX誘導的PCD反應，以明確候選基因是否具有抑制BAX誘導的PCD的功能。最終篩選得到一個能夠抑制BAX誘導的PCD。如圖所示注射含有BAX的農桿菌菌液的位置，出現(xiàn)了壞死；注射eGFP不能引起壞死；VmPxE1不能引起細胞壞死，但是能抑制BAX誘導的PCD反應，且抑制效率達到了92%（46/50）；接著由RT-PCR實驗，以本氏煙基因GAPDH為內參基因

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本文編號：2803904