發(fā)布時間：2020-08-22 04:11

【摘要】：煙草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)是近年來在我國發(fā)現(xiàn)的由立枯絲核菌引起的一種葉斑類新病害,造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大,其病原菌R.solani可通過產(chǎn)生毒素引起致病作用。本文對該病菌的產(chǎn)毒素發(fā)酵培養(yǎng)條件、毒素的活性成分和致病機(jī)理進(jìn)行了深入研究,結(jié)果如下:1.廣泛采集云南普洱市和臨滄市煙草種植區(qū)大面積發(fā)生的煙草靶斑病病葉標(biāo)本60余份,采用常規(guī)組織分離法獲得68個菌株。比較不同致病力煙草靶斑病菌菌株的產(chǎn)毒能力,發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)毒能力越強,其致病力也越強。選擇強致病力菌株SJ-8作為試驗材料,從發(fā)酵液種類、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值、光照條件、發(fā)酵方式、接種量和培養(yǎng)體積等影響因素對煙草靶斑病菌產(chǎn)毒發(fā)酵條件進(jìn)行了初步篩選。從試驗數(shù)據(jù)可知,采用改良的理查氏(Rhichard)培養(yǎng)液、于28℃、培養(yǎng)時間7天,pH值為7、光照與黑暗交替、間隔6h振蕩一次發(fā)酵液、接種量體積百分比為10%和培養(yǎng)體積為100ml為發(fā)酵液最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)條件。2.采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)法對煙草靶斑病菌毒素進(jìn)行分離純化,結(jié)合紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、元素分析以及核磁共振(NMR)等分析方法明確了毒素結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,經(jīng)TLC最佳展開系統(tǒng)95%乙醇:濃氨水:乙酸乙酯=10:1:1,獲得粗毒素;通過制備型HPLC對其再進(jìn)行分離純化,得到具有較高致病活性的精毒素組分Ⅰ和組分Ⅴ。經(jīng)紅外光譜、元素分析、質(zhì)譜檢測及核磁共振譜等技術(shù)手段分別對毒素組分Ⅰ和Ⅴ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定:毒素組分Ⅰ經(jīng)紅外光譜檢測后得知其結(jié)構(gòu)中含單取代苯、二烷醚(ROR’)、~+P-Ar、-CH_2-和-OCH_3結(jié)構(gòu)等,由元素分析和質(zhì)譜檢測可知其磷鹽正離子的分子量為307,結(jié)合核磁共振~1H-NMR分析、~(13)C-NMR和各種二維核磁譜結(jié)果,最終分析出毒素組分Ⅰ為甲氧基甲基三苯基氯化磷(C_(20)H_(20)ClOP)。毒素組分Ⅴ經(jīng)紅外光譜檢測數(shù)據(jù)可知其結(jié)構(gòu)中含羧酸(-COOH)、1,3-二取代苯、芳烷醚(ArOR)、-CH_2-和-OCH_3結(jié)構(gòu)等,根據(jù)元素分析和質(zhì)譜HRMS檢測結(jié)果可知[M-H]~-峰的測定質(zhì)量為165.0546,再結(jié)合核磁共振~1H-NMR分析、~(13)C-NMR和各種二維核磁譜,鑒定明確毒素組分Ⅴ為3-甲氧基苯乙酸(C_9H_(10)O_3)。3.為明確煙草靶斑病菌毒素的致病機(jī)制,本文研究了不同濃度3-甲氧基苯乙酸和甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素對煙草活性氧代謝、葉綠素含量及對葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響�；钚匝踉囼灲Y(jié)果表明,煙草葉片在分別被兩種毒素及兩種毒素混合組成的混合組分處理過后,激發(fā)葉片產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。葉片內(nèi)活性氧代謝增強,O~(2-)產(chǎn)生速率和H_2O_2產(chǎn)生量都有很大變化。葉綠素含量測定結(jié)果表明:經(jīng)3-甲氧基苯乙酸和甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素分別處理3d后的煙草葉片,其葉綠素含量均有所下降。且葉綠素含量降低百分比隨著毒素濃度增大而變大。電鏡觀察結(jié)果表明:經(jīng)3-甲氧基苯乙酸毒素處理12h時,葉肉細(xì)胞中線粒體脊的數(shù)量減少;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂。處理36h后,葉綠體的片層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)局部裂解;且線粒體開始裂解,脊基本消失。48h時,可觀察到葉綠體膜、基質(zhì)、線粒體完全消失;部分葉綠體僅殘留少量片層結(jié)構(gòu)。經(jīng)甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素處理葉片12h后,線粒體脊變粗;葉綠體的局部片層結(jié)構(gòu)開始裂解。處理36h后,線粒體呈空泡狀,且脊數(shù)量變少并裂解;葉綠體片層結(jié)構(gòu)幾乎全部裂解。48h時,細(xì)胞質(zhì)壁分離嚴(yán)重;葉綠體膜、片層結(jié)構(gòu)及線粒體完全消失。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.72
【圖文】：

圖 2-1 煙草靶斑病菌培養(yǎng)形態(tài)圖（示菌絲）Figure 2-1 Morphology of the pathogen of tobaccotarget spot disease. Coenocytic mycelium圖 2-2 病斑上觀察到病菌的子實體（示擔(dān)孢Figure 2-2 Hymenium of the pathogen obserthe lesions.Basidiospora表 2-2 立枯絲核菌的分離株及其來源Table 2-2 Isolates of Rhizoctina solani and their sources

圖 2-1 煙草靶斑病菌培養(yǎng)形態(tài)圖（示菌絲）Figure 2-1 Morphology of the pathogen of tobaccotarget spot disease. Coenocytic mycelium圖 2-2 病斑上觀察到病菌的子實體（示擔(dān)孢Figure 2-2 Hymenium of the pathogen obserthe lesions.Basidiospora表 2-2 立枯絲核菌的分離株及其來源Table 2-2 Isolates of Rhizoctina solani and their sources

從圖 2-3 可明顯看出，煙草靶斑病菌 SJ-8 在供試的五種培養(yǎng)液（ard 培養(yǎng)液、PD 培養(yǎng)液、PS 培養(yǎng)液、Fries 培養(yǎng)液和 Czapek 培養(yǎng)液毒素，但在改良 Richard 培養(yǎng)液中產(chǎn)生毒素量最強，病菌在其中生接種葉片產(chǎn)生的病斑直徑最大，可達(dá) 84.35mm。其次是在 PD 和 病菌產(chǎn)生的毒素接種葉片病斑直徑大小分別為 73.21mm 和 68.32m次之，毒素接種葉片產(chǎn)生病斑直徑為 43.87mm；而病菌在 Czapek的毒素接種葉片產(chǎn)生的病斑直徑最小，病斑直徑為 32.65mm。因此 Richard 培養(yǎng)液為煙草靶斑病菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)液。

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本文編號：2800245