【摘要】：九香蟲Aspongopus chinensis Dallas,1851是一種重要的藥食兩用資源昆蟲,具有較強(qiáng)的抗癌、抗菌、抗凝血、滋補(bǔ)、壯陽等作用。近年來,隨著九香蟲的抗癌、抑菌等藥用價(jià)值進(jìn)一步被人們所發(fā)現(xiàn),其市場需求與日俱增。但九香蟲野生資源數(shù)量有限,加之人們對其的破壞性采集及環(huán)境污染,野生蟲源逐年減少,人工繁殖九香蟲是解決其供不應(yīng)求的重要途徑。然九香蟲存在著嚴(yán)重的越冬滯育現(xiàn)象,一年僅發(fā)生一代。九香蟲大規(guī)模人工繁殖的實(shí)現(xiàn),首先需破解九香蟲滯育這一關(guān)鍵科學(xué)問題。且九香蟲滯育方面的研究尚未有個(gè)報(bào)道。因此,本研究圍繞可能影響九香蟲滯育的生理因素,探究其滯育期與滯育解除后體內(nèi)脂肪、糖類、蛋白質(zhì)的含量變化及滯育和滯育解除后保幼激素(保幼激素Ⅲ)(Juvenile hormoneⅢ,JHⅢ)和蛻皮激素(20-羥基蛻皮酮)(20-hydroxyecdysone,20E)的含量變化;明確外源保幼激素和蛻皮激素對九香蟲滯育的影響,并通過轉(zhuǎn)錄組測序分析滯育及滯育解除后九香蟲之間的基因表達(dá)差異,以期從多角度揭示影響九香蟲滯育的生理機(jī)制。具體研究結(jié)果如下:1.九香蟲滯育期脂肪、糖類和蛋白質(zhì)含量的變化為探索九香蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)變化與滯育的關(guān)系,本研究利用索氏提取法、蒽酮比色法和BCA蛋白定量試劑盒,分別測定了九香蟲滯育期(10月-次年4月)和滯育解除后(次年5月)體內(nèi)的脂肪、糖類和蛋白質(zhì)含量變化。結(jié)果顯示:九香蟲滯育期脂肪含量隨著時(shí)間推移逐漸降低,到滯育后期(4月)脂肪含量達(dá)到最低(19.51%±0.47%),與滯育初期(10月)的40.55%±1.48%相比存在顯著性差異(P0.05);糖類在滯育初期(10月)開始積累至11月,后不斷減少至次年4月,滯育解除后(次年5月)糖類的含量又顯著增高(P0.05);蛋白質(zhì)含量從滯育初期(10月)開始緩慢增加,直至次年3月開始下降,滯育解除后蛋白質(zhì)含量顯著低于滯育期(P0.05)。2.九香蟲滯育和滯育解除后體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素含量測定為了探究九香蟲滯育和滯育解除后體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素的含量變化,揭示保幼激素和蛻皮激素對九香蟲滯育的影響,本研究選取了滯育和滯育解除后的九香蟲成蟲為材料,采用高效液相色譜法測定其體內(nèi)JHⅢ和20E含量。結(jié)果表明:滯育和滯育解除后九香蟲體內(nèi)JHⅢ含量有一定的變化,滯育九香蟲JHⅢ含量(4.3016±0.0449 ng/μL)顯著低于滯育解除后含量(9.6873±1.6157 ng/μL);在滯育和滯育解除九香蟲中都未檢測到20E。3.外源保幼激素和蛻皮激素對九香蟲滯育的影響為驗(yàn)證保幼激素和蛻皮激素對九香蟲滯育的影響,分別對滯育九香蟲翅下注射不同濃度的外源JHⅢ和20E。結(jié)果顯示:注射外源JHⅢ30天后觀察到九香蟲發(fā)生交配行為;50 ng/μL實(shí)驗(yàn)組交配率最高(91.600%±0.038%),顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05);10、100、200 ng/μL實(shí)驗(yàn)組,交配率分別為21.700%±0.100%、39.330%±0.780%、21.880%±0.090%,沒有顯著差異(P≥0.05);而丙酮對照組(CK)和5 ng/μL實(shí)驗(yàn)組則沒有出現(xiàn)交配現(xiàn)象(P0.05)。注射外源20E,只有150、200 ng/μL實(shí)驗(yàn)組在37天后出現(xiàn)了交配現(xiàn)象,交配率分別為14.440%±0.100%和16.880%±0.080%,二者之間差異不顯著(P≥0.05)。4.滯育和滯育解除九香蟲轉(zhuǎn)錄組分析為更深入探索九香蟲滯育生理機(jī)制,本研究對滯育和滯育解除九香蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選差異表達(dá)基因,并挖掘滯育相關(guān)通路。利用Illumina HiSeq X Ten測序平臺對滯育和滯育解除九香蟲進(jìn)行高通量測序;共有336,230,260 clean reads通過組裝拼接得到80769個(gè)Unigenes基因,再將組裝獲得的轉(zhuǎn)錄組序列與六大數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比對注釋,其中共有44.78%(36169)的基因在數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。對滯育和滯育九香蟲測序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)量差異分析,共有3524個(gè)差異基因,其中有1350個(gè)基因上調(diào),2174個(gè)基因下調(diào)。應(yīng)用KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)上述基因參與了碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂肪代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯等生理過程。根據(jù)KEGG富集分析差異基因,其中富集到了昆蟲激素生物合成、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、胰島素合成等可能與九香蟲滯育相關(guān)的信號通路,為未來更深入研究滯育相關(guān)基因功能和破解九香蟲滯育難題提供依據(jù)和參考。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S899.9
【圖文】：

圖 3-1.保幼激素Ⅲ的標(biāo)樣色譜圖Fig.3-1 Standard chromatogram of JHⅢ根據(jù) JHⅢ標(biāo)樣，測定滯育九香蟲樣品中 JHⅢ含量得到的色譜圖（圖 3-此色譜圖中與標(biāo)樣圖相同的時(shí)間出現(xiàn)了一個(gè)較小的峰。圖 3-2.滯育九香蟲的保幼激素Ⅲ色譜圖Fig.3-2 Chromatograph of JHⅢ of diapause Aspongopus chinensis根據(jù) JHⅢ標(biāo)樣，測定滯育解除九香蟲樣品中 JHⅢ含量得到色譜圖（圖 3

圖 3-2.滯育九香蟲的保幼激素Ⅲ色譜圖Fig.3-2 Chromatograph of JHⅢ of diapause Aspongopus chinensis根據(jù) JHⅢ標(biāo)樣，測定滯育解除九香蟲樣品中 JHⅢ含量得到色譜圖（圖 色譜圖中相同的時(shí)間點(diǎn)上出現(xiàn)了一個(gè)峰，此峰較滯育九香蟲所測出的峰圖 3-3.滯育解除九香蟲的保幼激素Ⅲ色譜圖Fig.3-3 Chromatograph of JHⅢ of diapause termination Aspongopus chinensis以樣品與標(biāo)樣的峰面積比較定量，得到滯育和滯育解除后九香蟲 JHⅢ

Fig.3-1 Standard chromatogram of JHⅢ根據(jù) JHⅢ標(biāo)樣，測定滯育九香蟲樣品中 JHⅢ含量得到的色譜圖（圖 3-此色譜圖中與標(biāo)樣圖相同的時(shí)間出現(xiàn)了一個(gè)較小的峰。圖 3-2.滯育九香蟲的保幼激素Ⅲ色譜圖Fig.3-2 Chromatograph of JHⅢ of diapause Aspongopus chinensis根據(jù) JHⅢ標(biāo)樣，測定滯育解除九香蟲樣品中 JHⅢ含量得到色譜圖（圖 3此色譜圖中相同的時(shí)間點(diǎn)上出現(xiàn)了一個(gè)峰，此峰較滯育九香蟲所測出的峰

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7 李秉

本文編號：2792361