發(fā)布時間：2020-08-11 07:00

【摘要】：小麥條銹病是由專性寄生真菌——條形柄銹菌小麥�；�(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一種嚴重危害小麥生產的流行性真菌病害,對全球小麥生產造成了巨大的經濟損失。為實現小麥條銹病的持久防控,尋找新的能有效激發(fā)小麥防衛(wèi)反應的基因資源是主要措施之一。此前多項研究報道類枯草桿菌蛋白酶(subtilases,SBTs)可以在植物—病原互作過程中誘導寄主的過敏性壞死反應(HR)和系統(tǒng)獲得抗性(SAR),在植物抗病反應中起到重要作用。然而,關于植物類枯草桿菌蛋白酶家族基因在與活體營養(yǎng)專性寄生真菌互作的報道較少,尤其是小麥-條銹菌互作方面。本試驗室前期研究發(fā)現一個小麥類枯草桿菌蛋白酶TaSBT1可能參與小麥-Pst非親和互作,但編碼該蛋白的基因特性及其具體的功能和作用方式尚不清楚。本研究主要利用生物信息學分析、亞細胞定位技術、病毒誘導的基因沉默、qRT-PCR等方法對編碼該蛋白的基因TaSBT1的基本特性和功能進行了研究。研究結果為豐富小麥信號傳遞途徑,揭示小麥抗條銹病分子機理奠定了理論基礎。主要研究結果如下:1、TaSBT1基因的基本特性:TaSBT1在小麥基因組中具有三個同源序列TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d,分別位于小麥4A、4B、4D染色體上,TaSBT1a開放閱讀框長2,304 bp,編碼767個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.47 kD,理論等電點為5.79;TaSBT1b的ORF長2,310 bp,編碼769個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.61 kD,理論等電點為5.99;TaSBT1d的ORF長2,295 bp,編碼764個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.25 kD,理論等電點為5.71。TaSBT1編碼蛋白由信號肽、原結構域、類枯草桿菌蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域構成,與許多植物的類枯草桿菌蛋白酶親緣關系較近,與山羊草同源序列相似性高達99%。預測發(fā)現三個TaSBT1同源蛋白均具有N端信號肽,并且利用酵母信號肽篩選系統(tǒng)成功驗證了其編碼蛋白信號肽的分泌功能,亞細胞定位結果也同時證明了TaSBT1蛋白定位于細胞質膜外側。2、TaSBT1基因功能:通過qRT-PCR技術分析TaSBT1基因在小麥與條銹菌的互作中的表達特征,結果顯示TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d均在非親和互作中的12—24 h之間有強烈的上調表達,其中TaSBT1b在接種后12 h表達量最高為對照的7.2倍,TaSBT1a、TaSBT1d分別為對照的4.3倍、6.2倍;三者在接種后24 h也顯著高于對照,為未接種對照的2.5倍;而在親和互作中表達量無顯著變化。由此推測TaSBT1基因可能參與小麥對條銹菌的防御機制。采用農桿菌瞬時表達技術在煙草葉片中超量表達TaSBT1基因可以誘發(fā)植物細胞死亡,表明TaSBT1蛋白參與植物抗病反應中的PCD反應。進一步利用BSMV介導的基因沉默技術,選取目的基因的2個特異片段對小麥中的TaSBT1基因進行沉默,接種條銹菌非親和小種CYR20的對照小麥葉片觀察到明顯的過敏性壞死,但沉默植株產生大量的夏孢子堆;接種親和小種CYR33的小麥葉片觀察到目的基因沉默植株與對照相比產孢量無明顯變化,均產生大量夏孢子堆,并且通過臺盼藍染色發(fā)現后期沉默植株壞死面積相比對照植株減少。qRT-PCR分析證明沉默植株在接種CYR20和CYR33后,TaSBT1基因表達量均有不同程度下降。進一步說明TaSBT1基因沉默植株對CYR20的抗性顯著下降。3、TaSBT1基因可能參與的抗病信號途徑:通過外源激素SA、MeJA、ETH處理發(fā)現TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d基因均在SA處理0.5 h后被誘導上調表達,而在MeJA和ETH誘導后無顯著變化,由此推測TaSBT1基因可能參與水楊酸信號轉導途徑。另外,利用TaSBT1的同源蛋白AtSBT1.7蛋白進行STRING預測,發(fā)現互作可能性較高的蛋白有果膠甲酯酶抑制劑PMEI(AT2G47670)、白細胞介素-I-受體家族蛋白酶(AT2G17055)、類受體激酶BAM1(MPA24.5)、粘液質修飾蛋白(MUM2)和AAA型ATP酶家族蛋白(AT3G24530)。通過測定PME活性驗證TaSBT1和PMEI的作用,發(fā)現TaSBT1基因沉默葉片的粗蛋白酶液與對照植株相比在釕紅染色的瓊脂糖凝膠培養(yǎng)基上顯現更淺的顏色,暗示其PME活性提高。由此說明TaSBT1可以通過調節(jié)植物PME活性來影響植物抗病性,且TaSBT1基因沉默植株的PME活性降低,暗示TaSBT1基因可以提高植株PME活性。綜上所述,TaSBT1基因編碼類枯草桿菌蛋白酶,該基因參與小麥與條銹菌非親和互作過程,并調控小麥對條銹菌的抗病性。本研究為深入了解類枯草桿菌蛋白酶參與調控小麥對條銹菌免疫應答的分子機制奠定理論基礎,對持續(xù)全面防治小麥條銹病具有重要的理論意義。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.121.42

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳天利;李菊;張永艷;胡敏倫;閆化學;姜波;謝丹;袁超力;鐘廣炎;;柑橘類枯草桿菌蛋白酶基因CcSubtilisin的克隆及遺傳轉化[J];西南大學學報(自然科學版);2015年07期

2 盧東妹;;小麥條銹病綜合防治措施淺論[J];農技服務;2015年03期

3 宋震;李中安;周常勇;;病毒誘導的基因沉默(VIGS)研究進展[J];園藝學報;2014年09期

4 胡小平;王保通;康振生;;中國小麥條銹菌毒性變異研究進展[J];麥類作物學報;2014年05期

5 周彥;;果樹病毒載體研究進展[J];中國農業(yè)科學;2014年06期

6 郁有健;沈秀萍;曹家樹;;植物細胞壁同聚半乳糖醛酸的代謝與功能[J];中國細胞生物學學報;2014年01期

7 陳萬權;康振生;馬占鴻;徐世昌;金社林;姜玉英;;中國小麥條銹病綜合治理理論與實踐[J];中國農業(yè)科學;2013年20期

8 徐娜;;小麥條銹病的發(fā)生與防治[J];現代農業(yè)科技;2012年20期

9 霍治國;李茂松;李娜;王麗;黃大鵬;王春艷;;季節(jié)性變暖對中國農作物病蟲害的影響[J];中國農業(yè)科學;2012年11期

10 魏芳;馬鴻翔;;小麥抗赤霉病品種NBS同源序列克隆與分析[J];生物技術通報;2012年02期

相關博士學位論文 前4條

1 侯文倩;小麥赤霉病抗病相關基因的分離鑒定及BSMV-VIGS功能驗證[D];山東農業(yè)大學;2014年

2 湯春蕾;條銹菌與小麥互作中效應蛋白及誘導寄主細胞壞死基因的鑒定與功能分析[D];西北農林科技大學;2013年

3 王曉杰;小麥與條銹菌互作機理研究及抗條銹相關基因的功能分析[D];西北農林科技大學;2009年

4 洪薇;番茄抗葉霉病分子機理及抗病相關基因分離技術體系的建立[D];浙江大學;2007年

相關碩士學位論文 前5條

1 趙元元;田間感病小檗對小麥條銹病發(fā)生作用研究[D];西北農林科技大學;2017年

2 王亞茹;小麥抗條銹菌基因Yr10抗病通路的初步解析[D];西北農林科技大學;2017年

3 鞠樂;大麥（Hordeum VulgareL.）萌發(fā)期抗旱的生理機理及差異表達基因的篩選[D];石河子大學;2013年

4 徐紅明;小麥抗白粉病相關基因的克隆與分析[D];鄭州大學;2010年

5 馬猛;大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導小麥穗部基因有效沉默體系的建立[D];西北農林科技大學;2010年

本文編號：2788746