【摘要】：凝集素作為一種模式識(shí)別受體,在昆蟲免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,主要通過識(shí)別病原微生物表面的特定模式分子來激活昆蟲免疫防御系統(tǒng)。不同的凝集素含有的特異性碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD不同,能夠識(shí)別的病原微生物表面特定模式分子也不同。其中C型凝集素是鱗翅目昆蟲中凝集素的主要類型,是一種Ca~(2+)依賴的糖結(jié)合蛋白,對(duì)病原物表面的糖蛋白、糖脂都有較好的結(jié)合能力。本文以柞蠶凝集素為對(duì)象,對(duì)其序列特征、基因表達(dá)水平、重組蛋白的凝集活性進(jìn)行研究,以期進(jìn)一步明晰柞蠶免疫中模式識(shí)別受體—凝集素的功能及作用機(jī)理。1.本研究從柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出柞蠶凝集素相關(guān)序列,設(shè)計(jì)引物,克隆獲得4個(gè)柞蠶凝集素基因Lectin、Lectin16、Lectin21、CTL,并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和生物信息學(xué)分析:Lectin開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為678 bp,編碼225個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)(PI)為6.30,蛋白分子質(zhì)量(Mw)為26.11 kDa,1-19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽;Lectin16開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為708 bp,編碼235個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)(PI)為6.63,蛋白分子質(zhì)量(Mw)為26.99 kDa,1-34個(gè)氨基酸為信號(hào)肽;Lectin21開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為801 bp,編碼266個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)(PI)為6.70,蛋白分子質(zhì)量(Mw)為30.13 kDa,無信號(hào)肽;CTL開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為924 bp,編碼307個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)(PI)為5.11,蛋白分子質(zhì)量(Mw)為34.97 kDa,1-15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。2.利用半定量RT-PCR技術(shù)分析柞蠶凝集素基因在卵、幼蟲、蛹、成蟲4個(gè)發(fā)育時(shí)期的時(shí)間表達(dá)譜和幼蟲不同組織的空間表達(dá)譜。半定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)譜表明,4個(gè)凝集素基因在柞蠶各組織中表達(dá)存在差異。其中CTL分布廣泛,在除血漿和馬氏管以外的各組織中均有表達(dá)。其他3個(gè)基因主要在血細(xì)胞、中腸、脂肪體和生殖器官中表達(dá)。3.利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)柞蠶幼蟲中凝集素基因經(jīng)柞蠶微孢子蟲(Nosema pernyi)、柞蠶核型多角體病毒(Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus)、柞蠶鏈球菌(Streptococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)4種病原微生物及大腸桿菌(Escherichia coli)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平變化。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示經(jīng)不同病原物及大腸桿菌誘導(dǎo)后柞蠶凝集素基因在血細(xì)胞和中腸中的表達(dá)量均有明顯升高。經(jīng)5種不同微生物誘導(dǎo)以后,凝集素基因在感染細(xì)菌后基因表達(dá)量變化最顯著,其中感染大腸桿菌、核型多角體病毒后凝集素基因表達(dá)量變化最迅速,6-9 h高表達(dá);感染微孢子蟲以后凝集素基因表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)逐漸升高,在24 h后最高達(dá);在鏈球菌的誘導(dǎo)下凝集素基因表達(dá)量在9 h升至最高,然后逐漸降低;感染白僵菌后24 h凝集素開始高表達(dá)。4.將克隆所得基因與原核表達(dá)載體pEASY~?-E1 Expression vector相連后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),通過SDS-PAGE檢測(cè)表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒能夠表達(dá)與預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)量相一致的融合蛋白。Western blot結(jié)果顯示,純化后的菌液能夠雜交產(chǎn)生目的條帶。凝集試驗(yàn)驗(yàn)證了重組蛋白對(duì)大腸桿菌、鼠血紅細(xì)胞的凝集活性。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S884
【圖文】：

圖 2-1 柞蠶凝集素基因的 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)NAmark ，1-Lectin 擴(kuò)增產(chǎn)物，2-Lectin16 擴(kuò)增產(chǎn)物，3-Lectin21 擴(kuò)增產(chǎn)增產(chǎn)物Fig. 2-1Agarose gel electrophoresisof ApLectingenesDNAmark，1-Amplification productof A.pernyi Lectin，2-Amplification16，3-Amplification productof A.pernyiLectin21，4-Amplification produCTL集素基因的序列分析及蛋白質(zhì)序列同源比對(duì)蠶凝集素基因序列分析 我們獲得了柞蠶 Lectin、Lectin16、列，經(jīng) SMART 在線分析這 4 個(gè)基因均有 C 型凝集素家族特有其中 Lectin、Lectin16 含有 1 個(gè) CRD，Lectin21、CTL 含有 2 個(gè)析表明：Lectin 開放閱讀框架長(zhǎng)度 678bp，編碼 225 個(gè)氨基酸6.30，蛋白分子質(zhì)量（Mw）為 26.11 KDa，信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該分泌蛋白，保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?37 a~208 aa（圖 2-2A 藍(lán)色方框部分） 2-2A 紅色斜體部分），無跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)可能為分泌蛋白（圖6 開放閱讀框架長(zhǎng)度為 708bp，編碼 235 個(gè)氨基酸，推測(cè)其等

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文泌蛋白（圖 2-3）。Lectin21 開放閱讀框架長(zhǎng)度為 801bp，編碼 266 個(gè)氨基酸，推測(cè)其等電點(diǎn)（PI）為6.70，有 2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?1 aa~107 aa、119 aa~257 aa（圖 2-4A 藍(lán)色方框部分），其蛋白的分子質(zhì)量（Mw）為 27.13 KDa，無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)（圖 2-4）。CTL 開放閱讀框架長(zhǎng)度為 924 bp，編碼 307 個(gè)氨基酸，推測(cè)其等電點(diǎn)（PI）為5.11，有 2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?18 aa~146 aa、160aa~298 aa（圖 2-5A 藍(lán)色方框部分），其蛋白的分子質(zhì)量（Mw）為 34.97 KDa，1-15 位為信號(hào)肽（圖 2-5A 紅色斜體部分），無跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)可能為分泌蛋白（圖 2-5）。

圖 2-3 Lectin16 的生物學(xué)信息分析A-Lectin16 氨基酸序列分析，B-Lectin16 親水性分析C-Lectin16 信號(hào)肽分析，D-Lectin16 跨膜結(jié)構(gòu)列分析Fig. 2-3 BioinformaticsAnalysis of Lectin16A-Amino acid sequenceofLectin16，B-Predictionofhydrophilicity and hydrophobicityof lectin16C-Predictionof signal of Lectin16，D-PredictionoftransmembranestructureofLectin16

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