【摘要】：由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃櫨枯萎病已對北京等地紅葉景觀造成了嚴(yán)重的威脅。黃櫨枯萎病是一種系統(tǒng)性植物病害,藥劑作用效果差,且其病原菌在發(fā)病后期形成抗逆性極強(qiáng)的微菌核,目前尚無有效的防治措施。微菌核在病害循環(huán)中發(fā)揮極其關(guān)鍵的作用,揭示微菌核形成機(jī)制的分子基礎(chǔ)具有重要的理論意義和實踐價值。因此,本研究圍繞Septin家族,采用反向遺傳學(xué)方法,闡明該基因家族在微菌核形成和致病過程中的作用機(jī)制。研究結(jié)果如下:1)大麗輪枝菌Septin家族含有4個成員,即VdSep3(VDAG_00736)、VdSep4(VDAG_07169)、VdSep5(VDAG_04382)和VdSep6(VDAG_01474)。2)敲除VdSep3、VdSep4和VdSep6導(dǎo)致了突變體的孢子產(chǎn)量降低,而VdSep5基因缺失后突變體孢子產(chǎn)量相對于野生型增加。此外,所有的Septin基因均調(diào)控菌絲的極性生長以及幾丁質(zhì)的分布和運(yùn)輸。3)VdSep3和VdSep6基因分別對微菌核形成以及黑色素合成相關(guān)基因起負(fù)向調(diào)控作用和正向調(diào)控作用,而VdSep4和VdSep5基因?qū)ξ⒕诵纬梢约昂谏氐暮铣捎绊懖幻黠@。4)VdSep4基因的缺失會使大麗輪枝菌對幾丁質(zhì)抑制劑、高滲透脅迫、部分農(nóng)藥的抗性增強(qiáng),而其余3個Septin家族基因的缺失普遍會導(dǎo)致對逆境脅迫的抗性降低,表明Septin家族基因參與了逆境脅迫的應(yīng)答過程,但其分工不同。5)VdSep3、VdSep4以及VdSep5基因的缺失使侵入釘形成數(shù)量降低,菌絲侵入寄主的時間以及數(shù)量出現(xiàn)了延遲或降低,使得接種△VdSep3_2、△VdSep4_1和△VdSeP5_1的煙草病害程度顯著低于野生型,而VdSep6的缺失使突變體失去了直接侵入寄主植物的能力,表明Septin家族基因?qū)Υ篼愝喼那秩具^程至關(guān)重要。綜上,本研究揭示了大麗輪枝菌中的Septin家族基因在菌絲的生長發(fā)育、微菌核形成、脅迫應(yīng)答以及致病性等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此外,根據(jù)各Septin基因突變體的表現(xiàn),可以推斷不同的Septin家族基因在細(xì)胞內(nèi)具有不同的分工。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S763.7
【圖文】：

子顯微鏡發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在出芽繁殖時，Ｓｅｐｔｉｎ蛋白會在子細(xì)胞與母細(xì)胞連接處的細(xì)胞逡逑膜內(nèi)表面聚合形成一個ｌ0ｎｍ高的頸環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這個環(huán)使得子細(xì)胞和母細(xì)胞能正常分逡逑開，當(dāng)分裂結(jié)束后，這個環(huán)會消失，因此這種蛋白被命名為Ｓｅｐｔｉｎ（Ｂｙｅｒｓ，丨９７６；逡逑Ｇｌａｄｆｄｔｅｒ．ｅｔａｌ．．邋２００１）。Ｓｅｐｔｉｎ家族基因廣泛存在于除高等植物以外的真核生物當(dāng)中，逡逑目前為止，人們從釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)７種Ｓｅｐｔｉｎ家族基因，秀麗隱桿線蟲中２種，黑腹逡逑果蠅中５種，人類中１３種。逡逑１．６．邐２．邋Ｓｅｐｔｉｎ蛋白的結(jié)構(gòu)逡逑Ｓｅｐｔｉｎ家族基因所編碼的蛋白分子量在３０－６５ｋＤａ之間，大多數(shù)Ｓｅｐｔｉｎ蛋白具有逡逑在ＧＴＰ酶超家族成員中發(fā)現(xiàn)的一組ＧＴＰ酶基序，即Ｇ－丨、Ｇ－３和Ｇ－４（Ｆｉｅｌｄａｎｄ邋Ｋｅｌｌｏｇｇ，逡逑１９９９；邋Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ．邋２００３）。Ｓｅｐｔｉｎ蛋白的單體通常包含以下幾個部分：能與磷酸肌醇結(jié)逡逑合的堿性氨基酸區(qū)、ＧＴＰ結(jié)合域以及Ｓｅｐｔｉｎ獨有原件（ｓｅｐｔｉｎ邋ｕｎｉｑｕｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔ，邋ＳＵＥ），逡逑多數(shù)ＳＵＥ由氋度保守的５３個氨基酸組成；Ｓｅｐｔｉｎ蛋白的氨基末端（Ｎ－端）序列富含逡逑脯氨酸，絕大部分羧基末端（Ｃ－端）還含有一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，在不同的Ｓｅｐｔｉｎ蛋白逡逑中，兩端的序列在長度和組成上有非常大的差異（Ｍｏｓｔｏｗｙ邋ａｎｄ邋Ｃｏｓｓａｒｔ，邋２０１２；邋Ｐａｎ，邋ｅｔ逡逑ａｌ．，２００７；邋Ｖｅｒｓｅｌｅ，ｅｔ邋ａｌ”邋２００４）（圖邋１．１邋）。逡逑

邐１．引言邐逡逑失的現(xiàn)象；此外，Ｓｅｐｔｉｎ家族基因的缺失還會影響真菌等生長、產(chǎn)孢等。因此，探究逡逑Ｓｅｐｔｉｎ家族基因在微菌核形成以及侵染過程中的功能，可以為大麗輪枝菌微菌核形成逡逑和致病性等方面的分子機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)，同時，還可以為新型殺菌劑的開發(fā)逡逑與利用提供理論依據(jù)。逡逑１．８．研究內(nèi)容和技術(shù)路線逡逑本試驗利用ＪＧＩ等數(shù)據(jù)庫及Ｍｅｇａ邋５．０等序列分析軟件對大麗輪枝菌Ｓｅｐｔｉｎ家族逡逑基因進(jìn)行鑒定；采用ＰＥＧ介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法分別對ＶｄＳｅｐ３、ＶｄＳｅｐ４、ＶｄＳｅｐ５及逡逑ＶｄＳｅｐ６基因進(jìn)行敲除，以獲得對應(yīng)的敲除突變體。通過比對野生型ＸＳ１１菌株與各逡逑敲除突變體在生長速率、產(chǎn)孢情況、環(huán)境脅迫應(yīng)答、微菌核形成情況、炓色素與幾丁逡逑質(zhì)合成相關(guān)基因、ＲＯＳ相關(guān)基因的表達(dá)量以及致病力等方面的差異，明確大麗輪枝菌逡逑中Ｓｅｐｔｉｎ家族基因的主要功能。逡逑技術(shù)路線如下：逡逑

圖３．２邋ＶｄＳｅｐ４及其他真菌中的同源基?

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