發(fā)布時(shí)間：2020-08-02 10:01

【摘要】：核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair,NER)是非常重要的DNA損傷修復(fù)途徑,能夠?qū)ψ贤饩�誘導(dǎo)的DNA損傷進(jìn)行修復(fù),并且有了廣泛的研究。Rad23蛋白參與了損傷位點(diǎn)的識(shí)別過程,是NER中的一個(gè)很重要的修復(fù)蛋白。該蛋白在酵母和人體內(nèi)的研究已經(jīng)很多,但在家蠶體內(nèi)很少研究。本文對(duì)BmRad23的亞細(xì)胞定位、功能等進(jìn)行了初步分析。進(jìn)而,分析了紫外線輻射、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus,BmNPV)及家蠶細(xì)胞三者的相互影響,并通過過表達(dá)BmRad23及構(gòu)建表達(dá)BmRad23的重組病毒來分析BmRad23對(duì)病毒活性及受紫外線損傷的病毒的修復(fù)的影響,為改造防紫外線輻射的桿狀病毒提供理論依據(jù)。主要的研究結(jié)果如下:1.首先構(gòu)建表達(dá)融合蛋白BmRad23-egfp的質(zhì)粒,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)BmRad23主要定位在細(xì)胞核。宿主細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)BmRad23能幫助修復(fù)受紫外線損傷的報(bào)告基因。2.接著我們分析了BmNPV、紫外線和家蠶細(xì)胞的相互影響。通過細(xì)胞活性分析、凋亡分析及病毒滴度實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)紫外線輻射降低了細(xì)胞活性,促使細(xì)胞凋亡,使病毒滴度下降。同時(shí),受紫外線輻射的細(xì)胞不利于病毒的增殖。然而,在較高劑量的UV處理家蠶細(xì)胞后,BmNPV感染的細(xì)胞活性較未感染病毒的細(xì)胞更高,凋亡程度更低。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)無論家蠶細(xì)胞或BmNPV受到UV輻射后,家蠶DNA損傷修復(fù)基因BmRad23和BmRad4,BmNPV的損傷修復(fù)基因Bm65的表達(dá)均顯著上升,推測UV輻射后家蠶宿主及病毒可能互相利用相關(guān)蛋白來進(jìn)行損傷修復(fù)。而家蠶宿主細(xì)胞受到UV損傷后不利于病毒的增殖,病毒可能幫助宿主細(xì)胞盡快修復(fù)損傷,從而有利于自身更好地復(fù)制和增殖。同時(shí),qPCR結(jié)果顯示BmNPV感染后BmRad23及BmRad4的mRNA水平顯著上升,推測在BmNPV的復(fù)制增殖中可能利用了宿主這些蛋白。3.進(jìn)一步在BmN細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)BmRad23后,qPCR分析發(fā)現(xiàn)家蠶另一個(gè)損傷修復(fù)基因BmRad4及BmNPV的損傷修復(fù)基因Bm65的mRNA水平也隨之升高。推測BmRad23通過影響其它DNA損失修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)家蠶及BmNPV修復(fù)UV誘導(dǎo)的損傷。接著對(duì)Bm65缺失型病毒BmNPV(Bm65KO)的損傷修復(fù)進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用Bm65缺失型病毒和對(duì)照病毒分別感染宿主細(xì)胞時(shí),BmRad23及BmRad4的表達(dá)相差不大。當(dāng)這兩種病毒分別受UV損傷后,對(duì)照病毒感染的細(xì)胞中BmRad23及BmRad4的mRNA顯著高于用Bm65缺失病毒感染的細(xì)胞。我們推測病毒蛋白Bm65也可以通過影響家蠶宿主修復(fù)基因的表達(dá)來幫助修BmNPV自身的紫外線損傷。4.最后過表達(dá)BmRad23后,探究對(duì)病毒修復(fù)的影響。結(jié)果表明過表達(dá)該蛋白后有利于BmNPV的增殖,同時(shí)也有利于受UV損傷后的BmNPV的修復(fù)。接著我們構(gòu)建了過表達(dá)BmRad23的重組病毒,并且對(duì)重組病毒進(jìn)行滴度分析。結(jié)果表明插入修復(fù)基因BmRad23的重組桿狀病毒,活性升高,對(duì)UV的抗性也增強(qiáng)。由此表明,以宿主修復(fù)蛋白BmRad23為代表的NER修復(fù)蛋白,對(duì)受紫外線損傷的BmNPV具有修復(fù)作用,為改造新型、高效的桿狀病毒生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。同時(shí),在紫外線輻射后,家蠶和BmNPV的DNA損傷修復(fù)基因互相影響,協(xié)同幫助修復(fù)宿主和病毒的紫外線損傷,為進(jìn)一步探討桿狀病毒與宿主在進(jìn)化中的相互博弈關(guān)系提供參考。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S884.5
【圖文】：

家蠶 BmRad23 對(duì)受紫外線損傷的 BmNPV 作用的研究V 膜融合蛋白（envelope fusion protein，EFP）的不同，Alpha 桿狀病毒Group I和Group II兩種，其中 Group I以GP64 為出芽病毒（budded viru的融合蛋白，而 Group II 中沒有 GP64 蛋白，以 F 蛋白作為其 BVs 白[7]。

圖 1.2 桿狀病毒的生活周期[11]Fig 1.2 Life cycle of baculoviru. 桿狀病毒基因組研究桿狀病毒在感染細(xì)胞后的表達(dá)具有時(shí)序性，一般分為三個(gè)階段：早期基因和極晚期基因[12]。桿狀病毒在基因組復(fù)制之前，早期基因?yàn)椴《居拗骺剐缘壬顒?dòng)編碼所需的蛋白，如調(diào)控基因 IE-1、IE-2 和抵的 p35 等。這一過程一般發(fā)生在感染后 6 h 內(nèi)，病毒一般利用宿主酶 II 來完成早期基因的轉(zhuǎn)錄，并且還需要早期轉(zhuǎn)錄激活因子 IE-1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域[13]。晚期和極晚期基因的轉(zhuǎn)錄一般發(fā)生在 6-12 h 和是病毒利用自身編碼的 RNA 酶來編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和一些非必需衣殼蛋白 VP39 和 P10 等。盡管基因的編碼有時(shí)間先后之分，但他們

江蘇大學(xué)碩士論文皮膚的急性有害效應(yīng)，過度紫外線輻射可使皮膚發(fā)生皮炎，其癥狀表現(xiàn)為皮斑，癢，水腫和水泡，尤其是 UVB，過量照射可促進(jìn)皮膚的炎癥發(fā)生和色累。 慢性光化性皮炎（Chronic actinic dermatitis，CAD）是一種罕見的炎性病，該病的主要特征是對(duì)光特別敏感，遇光或紫外線會(huì)產(chǎn)生皮炎，容易出現(xiàn)易見光器官，如耳、胳膊、手背等[64]。

【參考文獻(xiàn)】

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1 張楠;時(shí)永香;王世芳;劉潔;吳克良;白增亮;;UVB影響中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育的初步研究[J];四川動(dòng)物;2007年02期

2 王冰,藤田和子,山田武,內(nèi)田信裕,三谷啟志;C譜紫外線對(duì)體外培養(yǎng)小鼠胚細(xì)胞的影響[J];輻射防護(hù);1997年03期

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1 陳默;紫外線誘導(dǎo)家蠶卵巢細(xì)胞（BmN-SWU1）凋亡的研究[D];西南大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2778362