發(fā)布時(shí)間：2020-08-01 17:31

【摘要】：家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)于2012年新設(shè)立的二分DNA病毒科中唯一的代表種。BmBDV特異性侵染家蠶中腸柱狀上皮細(xì)胞,病蠶體呈現(xiàn)軟化、中腸柱狀細(xì)胞濃核癥、中腸中后部變黃等癥狀。病毒基因組包含兩條線性ssDNA分子(VD1和VD2),分別獨(dú)立包裝于病毒衣殼中。VD1編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP以及VD2編碼的次要結(jié)構(gòu)蛋白P133在BmBDV侵染家蠶的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。前期研究表明,對(duì)BmBDV敏感的家蠶品系中腸細(xì)胞中表達(dá)一個(gè)含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NSD-2。而在對(duì)BmBDV具抗性的家蠶品系的中腸細(xì)胞中所表達(dá)的NSD-2蛋白則缺失一段跨膜區(qū)域,由此推測(cè)NSD-2蛋白可能為BmBDV感染宿主細(xì)胞的潛在受體。本研究的主要目的包括:(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)完整NSD-2蛋白的家蠶卵巢細(xì)胞系Bm N(+~(nsd-2));(2)體外表達(dá)BmBDV結(jié)構(gòu)蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞系中研究病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP與NSD-2蛋白的相互作用;(3)研究BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞系作為BmBDV體外感染敏感細(xì)胞系的潛力。本論文研究?jī)?nèi)容可分為以下三個(gè)部分:第一部分:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)完整NSD-2蛋白的家蠶卵巢細(xì)胞系BmN(+~(nsd-2))。首先構(gòu)建了表達(dá)BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的質(zhì)粒pIZ-+~(nsd-2)并轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞BmN。利用pIZ-V5/His載體自帶的Zeocin抗性篩選標(biāo)記,對(duì)轉(zhuǎn)染后的BmN細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選傳代30次后,獲得穩(wěn)定的家蠶細(xì)胞系BmN(+~(nsd-2))。通過(guò)western blotting和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)NSD-2蛋白的表達(dá)和+~(nsd-2)基因的轉(zhuǎn)錄,結(jié)果顯示在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中能夠檢測(cè)到NSD-2蛋白的表達(dá)以及+~(nsd-2)基因的轉(zhuǎn)錄;利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中的定位,結(jié)果顯示NSD-2蛋白主要定位在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞的細(xì)胞膜上。第二部分:體外表達(dá)BmBDV結(jié)構(gòu)蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞系中研究病毒結(jié)構(gòu)蛋白與NSD-2蛋白的相互作用。利用昆蟲(chóng)表達(dá)載體pIB/pIZ-V5/His構(gòu)建表達(dá)病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP以及次要結(jié)構(gòu)蛋白P133的表達(dá)質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞。制備了主要結(jié)構(gòu)蛋白VP單克隆抗體,并依據(jù)VP蛋白的β桶結(jié)構(gòu)構(gòu)建了表達(dá)不同長(zhǎng)度vp基因的質(zhì)粒。運(yùn)用western blotting檢測(cè)VP和P133蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中均能檢測(cè)到VP蛋白、P133蛋白以及NSD-2蛋白的表達(dá)。為了研究NSD-2蛋白與BmBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP間的相互作用,使用VP單克隆抗體能夠檢測(cè)到VP與NSD-2-V5融合蛋白共沉淀;其次使用V5標(biāo)簽多克隆抗體,可以檢測(cè)到NSD-2-V5融合蛋白與VP蛋白的共沉淀;結(jié)果表明VP與NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中具有相互作用。利用免疫熒光的方法檢測(cè)到VP與NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中有共定位。這些研究結(jié)果顯示NSD-2蛋白與BmBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP蛋白間存在相互作用。第三部分:研究BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞系作為BmBDV體外感染敏感細(xì)胞系的潛力。以純化的BmBDV病毒懸液(濃度:中腸腸干20 mg/mL)侵染BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞。利用熒光定量PCR技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)BmBDV基因的轉(zhuǎn)錄以及病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP的表達(dá),分析BmBDV對(duì)BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞的侵染性。然而,在侵染的BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中免疫熒光實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有檢測(cè)到病毒的入侵以及VP蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也沒(méi)有檢測(cè)到vp基因以及ns1基因的轉(zhuǎn)錄;暗示著B(niǎo)mBDV可能不入侵BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞或者不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的家蠶細(xì)胞系Bm N(+~(nsd-2)),潛在受體蛋白NSD-2與病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP間存在相互作用且在BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞中共定位;BmBDV可能不侵染BmN(+~(nsd-2))細(xì)胞系,表明NSD-2蛋白是主要但并不是病毒的唯一受體。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S884.5
【圖文】：

圖 1.1 BmBDV 的主要衣殼蛋白分析[21]Fig 1.1 Analysis of the major capsid protein of BmBDV[21]1.1.3 家蠶二分濃核病毒次要結(jié)構(gòu)蛋白 P133病毒粒子次要結(jié)構(gòu)蛋白 P133 由 VD2-ORF2 編碼，是具有 1161 個(gè)氨基酸以及分子量為 133kDa 的大蛋白[22]。p133 基因與 vp 基因不同，其只編碼單個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示，P133 蛋白與一些呼腸孤病毒科病毒（如家蠶質(zhì)形多角體病毒）的衣殼蛋白的 C-末端具有同源性，而且絲氨酸蛋白酶的 C末端也與 P133 蛋白的 C 末端具有相似性。CoCPV（云杉薊馬質(zhì)型多角體病毒）VP3 氨基酸序列的 768-789 位氨基酸是亮氨酸拉鏈，此位置是結(jié)合 DNA 的特征序列；并且 P133 蛋白與 CoCPV VP3 的氨基酸序列在亮氨酸拉鏈區(qū)域都比較保

因+nsd-2瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒的鑒定能夠介導(dǎo)BmBDV侵染家蠶，是病毒的潛在受體，因細(xì)胞株對(duì)研究BmBDV的入侵機(jī)制較為關(guān)鍵。為了建in篩選標(biāo)記的昆蟲(chóng)表達(dá)載體pIZ-V5/His并將目的基因了敏感性基因+nsd-2瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pIZ-+nsd-2。質(zhì)粒圖譜的陽(yáng)性質(zhì)粒分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切消化處理目的基因大小與理論值相符，證實(shí)pIZ-+nsd-2瞬時(shí)表片段PCR擴(kuò)增如圖2.2A所示；pIZ-+nsd-2重組質(zhì)粒酶切

基因+nsd-2片段PCR擴(kuò)增如圖2.2A所示；pIZ-+nsd-2重組質(zhì)粒酶切鑒定如圖2.2 B所示。圖 2.1 pIZ-+nsd-2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖Fig 2.1 Schematic organizationof pIZ-+nsd-2plasmid

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2777773