【摘要】：家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是國際病毒分類委員會(ICTV)于2012年新設立的二分DNA病毒科中唯一的代表種。BmBDV特異性侵染家蠶中腸柱狀上皮細胞,病蠶體呈現軟化、中腸柱狀細胞濃核癥、中腸中后部變黃等癥狀。病毒基因組包含兩條線性ssDNA分子(VD1和VD2),分別獨立包裝于病毒衣殼中。VD1編碼的主要結構蛋白VP以及VD2編碼的次要結構蛋白P133在BmBDV侵染家蠶的過程中發(fā)揮著重要的作用。前期研究表明,對BmBDV敏感的家蠶品系中腸細胞中表達一個含有12個跨膜結構域的氨基酸轉運蛋白NSD-2。而在對BmBDV具抗性的家蠶品系的中腸細胞中所表達的NSD-2蛋白則缺失一段跨膜區(qū)域,由此推測NSD-2蛋白可能為BmBDV感染宿主細胞的潛在受體。本研究的主要目的包括:(1)構建穩(wěn)定表達完整NSD-2蛋白的家蠶卵巢細胞系Bm N(+~(nsd-2));(2)體外表達BmBDV結構蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))細胞系中研究病毒結構蛋白VP與NSD-2蛋白的相互作用;(3)研究BmN(+~(nsd-2))細胞系作為BmBDV體外感染敏感細胞系的潛力。本論文研究內容可分為以下三個部分:第一部分:構建穩(wěn)定表達完整NSD-2蛋白的家蠶卵巢細胞系BmN(+~(nsd-2))。首先構建了表達BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的質粒pIZ-+~(nsd-2)并轉染家蠶卵巢細胞BmN。利用pIZ-V5/His載體自帶的Zeocin抗性篩選標記,對轉染后的BmN細胞進行篩選。篩選傳代30次后,獲得穩(wěn)定的家蠶細胞系BmN(+~(nsd-2))。通過western blotting和RT-PCR技術檢測NSD-2蛋白的表達和+~(nsd-2)基因的轉錄,結果顯示在BmN(+~(nsd-2))細胞中能夠檢測到NSD-2蛋白的表達以及+~(nsd-2)基因的轉錄;利用免疫熒光技術檢測NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細胞中的定位,結果顯示NSD-2蛋白主要定位在BmN(+~(nsd-2))細胞的細胞膜上。第二部分:體外表達BmBDV結構蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))細胞系中研究病毒結構蛋白與NSD-2蛋白的相互作用。利用昆蟲表達載體pIB/pIZ-V5/His構建表達病毒主要結構蛋白VP以及次要結構蛋白P133的表達質粒,分別轉染BmN(+~(nsd-2))細胞。制備了主要結構蛋白VP單克隆抗體,并依據VP蛋白的β桶結構構建了表達不同長度vp基因的質粒。運用western blotting檢測VP和P133蛋白的表達,結果顯示在BmN(+~(nsd-2))細胞中均能檢測到VP蛋白、P133蛋白以及NSD-2蛋白的表達。為了研究NSD-2蛋白與BmBDV主要結構蛋白VP間的相互作用,使用VP單克隆抗體能夠檢測到VP與NSD-2-V5融合蛋白共沉淀;其次使用V5標簽多克隆抗體,可以檢測到NSD-2-V5融合蛋白與VP蛋白的共沉淀;結果表明VP與NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細胞中具有相互作用。利用免疫熒光的方法檢測到VP與NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))細胞中有共定位。這些研究結果顯示NSD-2蛋白與BmBDV主要結構蛋白VP蛋白間存在相互作用。第三部分:研究BmN(+~(nsd-2))細胞系作為BmBDV體外感染敏感細胞系的潛力。以純化的BmBDV病毒懸液(濃度:中腸腸干20 mg/mL)侵染BmN(+~(nsd-2))細胞。利用熒光定量PCR技術和免疫熒光技術檢測BmBDV基因的轉錄以及病毒主要結構蛋白VP的表達,分析BmBDV對BmN(+~(nsd-2))細胞的侵染性。然而,在侵染的BmN(+~(nsd-2))細胞中免疫熒光實驗并沒有檢測到病毒的入侵以及VP蛋白的表達;實時熒光定量PCR技術也沒有檢測到vp基因以及ns1基因的轉錄;暗示著BmBDV可能不入侵BmN(+~(nsd-2))細胞或者不能在細胞內復制。綜上所述,本研究成功構建了穩(wěn)定表達BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的家蠶細胞系Bm N(+~(nsd-2)),潛在受體蛋白NSD-2與病毒主要結構蛋白VP間存在相互作用且在BmN(+~(nsd-2))細胞中共定位;BmBDV可能不侵染BmN(+~(nsd-2))細胞系,表明NSD-2蛋白是主要但并不是病毒的唯一受體。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S884.5
【圖文】：

圖 1.1 BmBDV 的主要衣殼蛋白分析[21]Fig 1.1 Analysis of the major capsid protein of BmBDV[21]1.1.3 家蠶二分濃核病毒次要結構蛋白 P133病毒粒子次要結構蛋白 P133 由 VD2-ORF2 編碼，是具有 1161 個氨基酸以及分子量為 133kDa 的大蛋白[22]。p133 基因與 vp 基因不同，其只編碼單個結構蛋白。氨基酸多序列比對結果顯示，P133 蛋白與一些呼腸孤病毒科病毒（如家蠶質形多角體病毒）的衣殼蛋白的 C-末端具有同源性，而且絲氨酸蛋白酶的 C末端也與 P133 蛋白的 C 末端具有相似性。CoCPV（云杉薊馬質型多角體病毒）VP3 氨基酸序列的 768-789 位氨基酸是亮氨酸拉鏈，此位置是結合 DNA 的特征序列；并且 P133 蛋白與 CoCPV VP3 的氨基酸序列在亮氨酸拉鏈區(qū)域都比較保

因+nsd-2瞬時表達質粒的鑒定能夠介導BmBDV侵染家蠶，是病毒的潛在受體，因細胞株對研究BmBDV的入侵機制較為關鍵。為了建in篩選標記的昆蟲表達載體pIZ-V5/His并將目的基因了敏感性基因+nsd-2瞬時表達質粒pIZ-+nsd-2。質粒圖譜的陽性質粒分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切消化處理目的基因大小與理論值相符，證實pIZ-+nsd-2瞬時表片段PCR擴增如圖2.2A所示；pIZ-+nsd-2重組質粒酶切

基因+nsd-2片段PCR擴增如圖2.2A所示；pIZ-+nsd-2重組質粒酶切鑒定如圖2.2 B所示。圖 2.1 pIZ-+nsd-2質粒結構圖Fig 2.1 Schematic organizationof pIZ-+nsd-2plasmid

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 張苗苗;馬瑛;潘曉利;胡朝陽;李國輝;司亞運;邢亞麗;陳克平;姚勤;;家蠶二分濃核病毒在家蠶細胞中的體外拯救[J];生物工程學報;2015年01期

2 HU ZhaoYang;LI GuoHui;LI GuangTian;YAO Qin;CHEN KePing;;Bombyx mori bidensovirus:The type species of the new genus Bidensovirus in the new family Bidnaviridae[J];Chinese Science Bulletin;2013年36期

3 胡朝陽;李國輝;李光田;姚勤;陳克平;;家蠶二分濃核病毒綜述[J];科學通報;2013年19期

4 趙清;李冬;;病毒受體及其研究現狀[J];動物醫(yī)學進展;2009年07期

5 張淑琴;馬學恩;周建華;;病毒受體研究進展[J];中國預防獸醫(yī)學報;2008年07期

相關博士學位論文 前1條

1 車紅磊;NDRG2（371）相互作用分子篩選[D];第四軍醫(yī)大學;2008年

相關碩士學位論文 前2條

1 朱彬彬;馬鈴薯Y病毒HC-Pro與加工番茄Cab-1A-like蛋白相互作用及其相關功能研究[D];石河子大學;2016年

2 李曉剛;家蠶對細小病毒樣病毒（中國株）非敏感性因子的初步研究[D];江蘇大學;2010年

本文編號：2777773