【摘要】：棗縮果病是一種在棗生產(chǎn)上造成重大經(jīng)濟(jì)損失的病害,為了找到合適的防治方案,本研究對(duì)棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌(Alternaria alternata)的侵染特性和抗藥性進(jìn)行了研究。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì)CN193菌株進(jìn)行g(shù)fp標(biāo)記,采用花期噴霧接種法和幼果期接種法用CN193::gfp對(duì)棗樹進(jìn)行侵染,并用CN193::gfp對(duì)可能的潛在寄主植物進(jìn)行致病力測(cè)定,確定潛在寄主,在此基礎(chǔ)上篩選適合棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌(A.alternata)研究的替代寄主,最后以CN191、CN192、CN193和CN194菌株為研究對(duì)象檢測(cè)互隔鏈格孢菌(A.alternata)對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑抗藥性。主要結(jié)果如下:采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)換的方法將含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒導(dǎo)入CN193中,并得到成功表達(dá)gfp的CN193菌株,且標(biāo)記菌株在經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)后,仍具有良好的發(fā)光表型,能穩(wěn)定表達(dá)gfp蛋白,并且標(biāo)記菌株CN193::gfp對(duì)棗果保持了原有的致病力。林間采用花期噴霧法和幼果期刺傷法接種CN193::gfp,觀察發(fā)病情況及癥狀,用潮霉素B平板分離回收接入的病原菌CN193::gfp,并檢測(cè)熒光。結(jié)果表明,用潮霉素B平板分離回收,檢測(cè)到CN193::gfp菌株可在花期和幼果期的傷口處侵入,且均可使花期噴霧接種、幼果期刺傷接種枝條上的棗果和其同株未接種枝條上的棗果發(fā)病。選取棗園周圍栽植的番茄、煙草、蘋果、梨、毛白楊和加楊,用CN193::gfp的孢子懸浮液進(jìn)行刺傷和無(wú)傷接種,將發(fā)病部位病健交界處組織置于加有10μg·mL~(-1)潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),熒光顯微鏡下觀察發(fā)病組織和從各寄主上分離獲得的病菌菌絲。刺傷接種7 d后,除煙草外,其他刺傷的材料均發(fā)病,發(fā)病率依次為番茄果實(shí)45.8%、蘋果果實(shí)79.2%、蘋果葉片75.0%、梨果實(shí)56.3%、梨葉片52.1%、毛白楊葉片66.7%和加楊葉片54.2%;無(wú)傷處理的僅番茄發(fā)病,其他材料和對(duì)照組均未發(fā)病。番茄病部組織的熒光清晰可辨;在發(fā)病的番茄果實(shí)、蘋果果實(shí)和葉片、梨果實(shí)和葉片、毛白楊和加楊離體葉片病部組織分離后長(zhǎng)出的菌絲中,均可以觀察到明顯的熒光。棗縮果病菌能成功侵染番茄、蘋果、梨、毛白楊和加楊,并可使各寄主植物產(chǎn)生與番茄黑斑病、蘋果褐紋病、梨黑斑病和楊樹葉枯病相同的癥狀,推斷番茄、蘋果、梨、毛白楊和加楊為棗縮果病菌的潛在寄主,擴(kuò)大了棗縮果病菌初侵染來(lái)源的范圍。采用刺傷、無(wú)傷和噴霧接種的方法在活體的番茄和煙草上接種CN193孢子懸浮液,待發(fā)病后分離各病原菌回接到棗果上檢測(cè)其致病性,并用番茄黑斑病菌侵染棗果,對(duì)番茄黑斑病菌進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定。結(jié)果表明,活體番茄花期噴霧接種和幼果期刺傷接種均發(fā)病,且番茄花期接種與棗花期接種的發(fā)病癥狀相似;活體煙草花期和刺傷接種均未發(fā)病;將各分離物回接到棗果上,棗果均發(fā)病且發(fā)病率與對(duì)照組CN193的發(fā)病率無(wú)顯著性差異;番茄黑斑病菌刺傷接種棗果發(fā)病,且癥狀與CN193相同;番茄黑斑病菌與CN193的菌落性狀、產(chǎn)孢表型和形態(tài)均無(wú)差異,結(jié)合分子鑒定結(jié)果將番茄黑斑病菌鑒定為互隔鏈格孢菌(A.alternata),且與CN193相似性為100%。因此,番茄適合作為棗縮果病初侵染病菌的替代寄主,為快速篩選防治藥劑奠定了基礎(chǔ)。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了CN191、CN192、CN193和CN194菌株,對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑這2種藥劑的敏感性;選取對(duì)這2種藥劑最為敏感的菌株進(jìn)行抗藥性篩選,并以篩選到的抗藥菌株為試驗(yàn)對(duì)象測(cè)定其對(duì)另一種藥劑的敏感性。2016和2017年,在林間施用過和未施用過這2種藥劑的棗園用這2種藥劑進(jìn)行防治試驗(yàn),并于發(fā)病初期和盛期調(diào)查發(fā)病率。結(jié)果表明,CN194對(duì)這2種藥劑都很敏感,經(jīng)誘導(dǎo)后得到穩(wěn)定的抗異菌脲突變體CN194y,與苯甲丙環(huán)唑沒有交互抗性。在施用過這2種藥劑的林間,苯甲丙環(huán)唑的防治效果較好,分別為81.3%和51.3%;在未施用過這2種藥劑的林間,異菌脲的防治效果較好,分別為92.9%和68.4%。不同地區(qū)棗縮果病菌對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的敏感性各異,但敏感趨勢(shì)相同;互隔鏈格孢菌(A.alternata)對(duì)異菌脲易產(chǎn)生抗藥性,對(duì)苯甲丙環(huán)唑不易產(chǎn)生抗藥性,且2種藥劑之間無(wú)交互抗性。林間防治以異菌脲和苯甲丙環(huán)唑交替施用方案為佳。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.65
【圖文】：

菌 CN193的 gfp 標(biāo)記孢菌 CN193對(duì)潮霉素 B 的敏感性 CN193 菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程為 y＝1.122 4x＋7.809 5，相關(guān)mL-1，因此，CN193 對(duì)潮霉素 B 的敏感性較強(qiáng)，且潮霉素 B 的 CN193及其穩(wěn)定性fp 接種到無(wú)潮霉素 B 的 PDA 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng) 5 代，在熒光顯見菌絲中的熒光（圖 3-1A），且與繼代培養(yǎng) 5 代前的 CN193:度無(wú)差異。將在無(wú)潮霉素 B 的 PDA 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng) 5 代后的含有 10 μg mL-1潮霉素 B 的培養(yǎng)基上，菌落可以正常生長(zhǎng)CN193::gfp 和野生型菌株 CN193 在無(wú)潮霉素 B 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)野生型菌株 CN193 的菌落塊直徑分別為（5.43±0.03）和（5.50±果表明，gfp 標(biāo)記的 CN193 菌株遺傳轉(zhuǎn)化后的特征明顯且穩(wěn)定。A B

將在無(wú)潮霉素 B 的 PDA 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng) 5 代后的 10 μg mL-1潮霉素 B 的培養(yǎng)基上，菌落可以正常生長(zhǎng)3::gfp 和野生型菌株 CN193 在無(wú)潮霉素 B 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株 CN193 的菌落塊直徑分別為（5.43±0.03）和（5.50±，gfp 標(biāo)記的 CN193 菌株遺傳轉(zhuǎn)化后的特征明顯且穩(wěn)定。鏡下觀察繼代 5 代后的 CN193::gfp（A）和初代的 CN193::gfp（B）e hyphae of CN193::gfp after 5 subcultures (A) and CN193::gfp with no sufluorescence microscope193的致病力A BA B

于成熟前脫落；幼果期刺傷接種部位出現(xiàn)紅褐色略凹陷的病斑（圖3-3B），于成熟前脫落；自然發(fā)病的棗果于成熟前變紅褐色皺縮（圖 3-3C），且成熟前脫落。無(wú)論是花期噴霧，還是幼果期刺傷接種，它們的發(fā)病癥狀和病變過程都與自然發(fā)病的表現(xiàn)基本相似。3.2.2 不同部位的棗果中檢測(cè) CN193::gfp圖 3-4 熒光顯微鏡下不同部位病果中分離的菌絲Fig. 3-4 Observation of the hyphae isolated from different parts of the disease fruits under fluorescence microscope注：A：花期噴霧接種枝條上的病果中的菌絲；B：花期噴霧同株未接種枝條上的病果中的菌絲；C：幼果期刺傷接種的病果中的菌絲；D：同株靠近幼果期刺傷接種枝條，但未接種枝條上的病果中的菌絲。Note: A: Hyphae from diseased fruits by inoculation of flower spraying; B: Hyphae from diseased fruits on the non-inoculated neighbouringbranches close to inoculated branches by flower spraying; C: Hyphae from diseased fruits by inoculation of needle stabbing; D: Hyphae fromdiseased fruits on the non-inoculatedneighbouringbranches close to inoculated branches by needle stabbing.5 cmA0.5cmB5cmCA B C D

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2775064