【摘要】：棗(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科(Rhamnaceae)植物,是我國的重要果樹樹種。棗樹的栽培過程中常常伴隨著病蟲害的發(fā)生,其中最為嚴重的是由植原體侵染而引起的棗瘋病,堪稱棗樹的癌癥。為研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在棗瘋病發(fā)病過程中可能發(fā)揮的作用以及棗與植原體的相互作用機制,利用生物信息學(xué)的方法,鑒定出棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,并對棗瘋病發(fā)病過程中部分棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平進行分析和熒光定量PCR試驗驗證,同時分析了水楊酸和茉莉酸甲酯處理后幾個棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達量變化。主要結(jié)果如下:1、通過嫁接轉(zhuǎn)染植原體,提取植原體侵染后不同時期的棗葉片RNA,進行轉(zhuǎn)錄組測序。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫信息,鑒定出69個棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子,并對其進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建,染色體定位,保守結(jié)構(gòu)域比對及基序分析。結(jié)果顯示69個棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子都含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域,可分為Group I,Group II以及Group III 3個亞組,分別含有17、41、11個成員,且不均勻的分布在棗樹的12條染色體上,在7號染色體上沒有匹配到相應(yīng)的ZjWRKY轉(zhuǎn)錄因子。2、從棗瘋病發(fā)生過程中棗葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測到28個ZjWRKY轉(zhuǎn)錄因子的差異表達主要集中在嫁接后38-52 w。對表達量上調(diào)的6個基因ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69進行熒光定量PCR驗證,試驗結(jié)果顯示在棗瘋病發(fā)病過程中ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61、ZjWRKY69基因表達量發(fā)生明顯變化(上調(diào))。說明這幾個基因可能在棗樹防御植原體的過程中發(fā)揮作用。3、為進一步分析研究棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植原體防御過程中的潛在作用,我們用水楊酸和茉莉酸甲酯處理棗胚培苗,熒光定量PCR檢測ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因在處理不同時間的表達量變化,試驗結(jié)果顯示SA處理后,ZjWRKY42和ZjWRKY52的表達量顯著升高;MeJA的積累誘導(dǎo)了ZjWRKY42和ZjWRKY61的表達量發(fā)生較明顯變化。4、構(gòu)建了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因的過表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草,分別獲得了15個轉(zhuǎn)ZjWRKY8基因的抗性芽,28個轉(zhuǎn)ZjWRKY52基因的抗性芽,16個轉(zhuǎn)ZjWRKY61基因的抗性芽。5、ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因在煙草葉片中瞬時過量表達后,用0.1 mol·L~(-1)的H_2O_2處理葉片,結(jié)果顯示ZjWRKY8、ZjWRKY61基因過表達的煙草葉片中CAT的活性水平都高于對照,而SOD活性只在0-12 h高于對照葉片;DAB組織化學(xué)染色結(jié)果顯示ZjWRKY8過表達的煙草葉片中黃色沉淀明顯增加。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.65
【圖文】：

3.2 棗 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥 WRKY 家族的進化樹分析及其分類依據(jù)棗WRKY蛋白與擬南芥WRKY蛋白的相似性進行聚類分析，將69個WRKY蛋白分為3個組Group I、Group II和Group III，且與擬南芥的分組相對應(yīng)。根據(jù)棗與擬南芥的同源進化樹（圖2-1）可以看出，有17個ZjWRKY屬于Group I；Group II中含有41個WRKY成員，可細分為II a 、II b、II c、II d、II e 5個亞組，所含WRKY成員分別為3個、11個、15個、3個、9個；Group III含有11個ZjWRKY成員。由圖2-1發(fā)現(xiàn)，在每個分組中均包含有AtWRKYs和ZjWRKYs，如Group I中有17個棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子，13個擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，說明兩個物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蛋白結(jié)構(gòu)上有一定的保守性。同一個分組內(nèi)

Fig. 2-1 The phylogenetic tree of WRKY transcription factors in jujube and Arabidopsis3.3 棗 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的染色體定位利用Mapinspect軟件對棗WRKY蛋白進行染色體定位，結(jié)果如圖2-2（圖左側(cè)cM為基因圖距單位），只有43個棗WRKY基因可以定位到棗的11條染色體上，26個棗WRKY基因沒有可以匹配的染色體定位信息（未獲得染色體定位信息）。在棗的12條染色體上，7號染色體上沒有定位到任何棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其余11條染色體上都分布有不等數(shù)量的棗WRKY基因。11號染色體上分布最多，含有8個ZjWRKY基因（ZjWRKY30- ZjWRKY37），占11.60%，其次是1號染色體

我們利用DNAMAN軟件對棗WRKY蛋白進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子都含有WRKYGQK的保守結(jié)構(gòu)，而ZjWRKY23、ZjWRKY46是WRKYGKK結(jié)構(gòu)，這兩個轉(zhuǎn)錄因子都屬于GroupII c亞組（圖2-3）。利用MEME在線工具對棗WRKY蛋白的保守基序進行預(yù)測分析，得到10個保守基序，并將其命名為motif 1-motif 10（圖2-4）。motif 1和motif 2包含有WRKY蛋白標志性的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域。motif 1結(jié)構(gòu)最為保守，ZjWRKY40（Group II c）和ZjWRKY49（Group II b）以外的67個棗WRKY蛋白均含有該結(jié)構(gòu)。10個WRKY轉(zhuǎn)錄因子不含有motif 2結(jié)構(gòu)，分別為Group I的ZjWRKY1、11、49，GroupII a的ZjWRKY48，Group II b的ZjWRKY40、54，Group II e的ZjWRKY42以及Group III中的ZjWRKY3、13、26。其次motif 3、4、5也較為保守

【參考文獻】

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本文編號：2761832