【摘要】：稻瘟病是限制水稻高產(chǎn)的主要病害之一。由于稻瘟病菌生理小種的易變性,所推廣的抗稻瘟病品種常常在種植不久之后就喪失其抗病性,導(dǎo)致其失去使用價值。因此,快速、有效地篩選和利用優(yōu)良的抗稻瘟病品種一直是國內(nèi)外研究重點(diǎn)。其中,抗稻瘟病基因分子鑒定是水稻抗稻瘟病材料輔助選擇的重要方面。針對目前抗稻瘟病基因分子鑒定主要是以DNA為模板定性檢測水稻中抗性基因的有無及組成,不能鑒定抗稻瘟病功能基因是否表達(dá)的不足,本文以水稻所含的稻瘟病抗性基因(已被克隆,且為江蘇省水稻品種的主要抗病基因)為對象,集成和研發(fā)了抗稻瘟病功能基因組成、表達(dá)鑒定和病菌接種鑒定技術(shù)體系。主要研究結(jié)果如下:1.稻瘟病菌的培養(yǎng)及接種方法比較本實(shí)驗首先對所收集和保存的稻瘟病菌進(jìn)行培養(yǎng),獲得稻瘟病菌孢子液。在此期間對水稻進(jìn)行培養(yǎng),于三葉一心期分別用噴施法、創(chuàng)傷法、誘發(fā)法進(jìn)行稻瘟病菌接種,結(jié)果表明,創(chuàng)傷法對水稻傷害較大,易造成水稻枯萎,影響結(jié)果。所以噴施法接種相對較好。2.抗稻瘟病基因鑒定方法的研發(fā)、集成與應(yīng)用利用水稻稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記,研發(fā)了同時檢測稻瘟病抗性基因Pikh與Pi1的多重PCR體系,集成了同時檢測稻瘟病抗性基因Pita與Pib的多重PCR體系。由于Pikm是由兩個緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因組成,故建立了分別檢測Pikm1-TS和Pikm2-TS兩個片段的Pikm基因鑒定方法。并用這兩套體系和Pikm基因鑒定方法對江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的114份雜交后代水稻材料中的抗病基因Pita、Pib、Pikh、Pi1和Pikm進(jìn)行了檢測,以確定這些雜交后代水稻材料中抗稻瘟病基因的分布情況。檢測結(jié)果表明,114份材料中含抗稻瘟病基因Pita的有81份,含Pib的有106份,含Pikh的有35份,含Pikm的有13份,含Pi1的僅有3份。分別占檢測材料的71.0%、92.9%、30.7%、11.4%、2.6%,表明了Pib、Pita和Pikh這三個抗稻瘟病基因廣泛存在于江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的雜交后代水稻材料中。這可能與該公司在雜交配組時注重對抗稻瘟病親本的選擇和選育過程中長期注重對稻瘟病抗性的篩選有關(guān)。3.水稻對穗頸瘟抗性的稻瘟病菌接種鑒定對田間水稻進(jìn)行稻瘟病菌接種,接種7 d后進(jìn)行病情調(diào)查。穗頸瘟接種鑒定結(jié)果表明:114份材料中經(jīng)人工接種鑒定表現(xiàn)為高抗的有2份,抗病的有27份,中抗的有32份,感病的有33份,高感的有20份。分別占鑒定總數(shù)的1.7%、23.7%、28.1%、28.9%、17.5%�？沟疚敛』蚝退腩i瘟抗性之間的相關(guān)性分析表明:Pita、Pikh基因與穗頸瘟的抗性呈顯著(P0.05)的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.297、0.239。Pib、Pi1和Pikm基因與穗頸瘟的抗性之間相關(guān)性不顯著。4.水稻對稻瘟病抗性的基因表達(dá)評價本試驗針對多數(shù)育種單位不具備配備熒光定量PCR儀的實(shí)際情況,研發(fā)了抗稻瘟病基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR便捷檢測技術(shù)。以Ubq5為內(nèi)參,選擇Pb、Pita和Pikh為抗性基因進(jìn)行檢測。在所抽檢的11個材料中,盡管Pita基因是組成型表達(dá),但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)在抗稻瘟病材料中該基因的表達(dá)仍然受到稻瘟病菌接種的誘導(dǎo)。Pikh和Pib基因是誘導(dǎo)型表達(dá),稻瘟病菌接種后Pikh和Pib基因在抗稻瘟病材料中上調(diào)表達(dá),而在感稻瘟病材料中Pikh和Pib基因均明顯下調(diào)表達(dá)。這表明,在抗稻瘟病水稻材料中抗稻瘟病基因Pib、Pita和Pikh的表達(dá)受到稻瘟病菌接種處理的誘導(dǎo),而在感稻瘟病水稻材料中這種表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯,甚至Pikh和Pib基因出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。這一方面說明,抗稻瘟病基因表達(dá)水平可用于對含有抗稻瘟病主效基因水稻品種的抗性評價,另一方面說明,瘟病菌接種處理后抗稻瘟病基因的差異表達(dá)能更合理解釋在生產(chǎn)上某些含有抗稻瘟病主效基因的水稻品種其抗性經(jīng)常表現(xiàn)不理想的現(xiàn)象。5.水稻受稻瘟病侵染標(biāo)志基因預(yù)測方法的建立根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測結(jié)果,篩選出一個有可能作為一個水稻是否受到稻瘟病侵染的標(biāo)志基因(Barwin),經(jīng)本文所研發(fā)的半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),不管在抗稻瘟病材料還是感稻瘟病材料中Barwin基因均隨稻瘟病菌接種時間的推移其表達(dá)量逐步升高。因此,可通過檢測Barwin基因表達(dá)水平隨時間的變化來預(yù)測特定品種或特定田塊的水稻是否受到稻瘟病侵染。6.感稻瘟病材料標(biāo)志基因表達(dá)鑒定方法的建立根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測結(jié)果,篩選出兩個有可能作為感稻瘟病水稻材料鑒定的標(biāo)志基因,即與防御相關(guān)的幾丁質(zhì)酶3和葡聚糖內(nèi)切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因。據(jù)此,本文設(shè)計引物并建立了這兩個基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR檢測方法。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩個基因的表達(dá)在感稻瘟病水稻材料中受到稻瘟病菌接種的顯著誘導(dǎo),在抗稻瘟病材料中未見表達(dá)或者表達(dá)量很低。因此,可以通過檢測這兩個基因在稻瘟病菌接種條件下的表達(dá)水平鑒別某水稻材料是否為感稻瘟病材料。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.111.41
【圖文】：

以去年己鑒定的４個材料，Ｐ３２邋（含有尸／ｔｏ、Ｐ／６、朽姑、Ｐｚ７基因）、Ｐ１６５邋（含Ｐ沾基逡逑因）、Ｐ１７８邋（含戶／ｔｏ、尸訪、Ｐ／妨基因）、Ｐ２１８邋（含Ｐ／６、乃７基因）為ＤＮＡ模板進(jìn)行ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見圖３－３。圖３－３表明，本試驗己成功研發(fā)出能同時檢測Ｐ／從和Ｐ／７逡逑基因的多重ＰＣＲ體系Ｉ，同時建立了能同時檢測和乃Ｙａ基因多重ＰＣＲ體系ＩＩ，并且逡逑能擴(kuò)增出和八７、和基因片段清晰的條帶（圖３－３）。逡逑圖３－３體系Ｉ和體系ＩＩＰＣＲ擴(kuò)增優(yōu)化結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｔｈｅ邋ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｓｙｓｔｅｍ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑注：Ａ表示體系Ｉ的優(yōu)化結(jié)果；Ｂ表示體系ＩＩ的優(yōu)化結(jié)果。逡逑利用水稻抗稻瘟病基因Ｐ／妨和Ｐｚ７、Ｐ／ｔａ和的多重ＰＣＲ檢測體系，于２０１７年對逡逑江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的１１４份雜交后代水稻材料中的抗稻瘟病基因組成進(jìn)行逡逑了檢測，不同水稻材料中抗稻瘟病基因組成的多重ＰＣＲ檢測結(jié)果圖３－４和３－５所示，圖３－４逡逑顯示了朽似和Ｐ沾的檢測結(jié)果，圖３－５顯示了邋Ｐ／Ｍ和八７的檢測結(jié)果。含乃Ｙａ、／％和尸拙、逡逑朽７基因的材料可以分別擴(kuò)增出１０２４邋ｂｐ、３６５邋ｂｐ和２１６／３５９邋ｂｐ、４６０邋ｂｐ的特異性片段，不逡逑含抗性基因的材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測，１１４份材料中含稻瘟病基因Ｐ／ｔｏ的８１份，含逡逑Ｐ泌的有１０６份，含尸焌的３５份

注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋１８個循環(huán)；２０個循環(huán)；２２個循環(huán)；２４個循環(huán)；２６個循環(huán)；２８個循環(huán)。逡逑將２２個材料分為抗稻瘟病和感稻瘟病兩組，分別進(jìn)行模板濃度的調(diào)試，使各個材料逡逑在２４個循環(huán)時Ｕｂｑ５的亮度保持一致。調(diào)試結(jié)果如圖３－８和圖３－９。圖中結(jié)果表明，各樣逡逑品ｃＤＮＡ濃度基本調(diào)適一致，可以進(jìn)行各基因的半定量分析。逡逑

邐４３逡逑ｉ？§：Ｌ—．羞」逡逑圖３－８抗稻瘟病材料模板濃度的調(diào)試結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－８邋Ｄｅｂｕｇｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｒｉｃｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋】０３５處理、ｊ0３５對照、ＪＩ０４５處理、〗０４５對照、】０５９處理、ｊ0５９對照、ｊ0７０逡逑處理、Ｊ０７０對照、Ｊ０８５處理、Ｊ０８５對照、Ｊｌｌ丨處理、川１對照、Ｊ１３１處理、Ｊ１３１對照材料的Ｕｂｑ５表逡逑達(dá)量。逡逑圖３－９感稻瘟病材料模板濃度的調(diào)試結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－９邋Ｄｅｂｕｇｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｒｉｃｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋Ｋ）１９處理、＊Ｊ０１９對照、Ｊ０２４處理、Ｊ０２４對照、＊１０６５處理、Ｊ０６５對照、Ｊ１２５逡逑處理、Ｊ１２５對照材料的Ｕｂｑ５表達(dá)量。逡逑３．邋７．邋２抗稻瘟病基因表達(dá)水平的半定量ＲＴ－ＰＣＲ檢測逡逑對各個基因進(jìn)行循環(huán)數(shù)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2761174