【摘要】：炭疽病是我國(guó)油茶產(chǎn)區(qū)油茶上重要病害之一,嚴(yán)重影響了油茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前,關(guān)于油茶炭疽病的系統(tǒng)性研究報(bào)道較少。本文研究了我國(guó)油茶主產(chǎn)區(qū)油茶炭疽病的病原,根據(jù)形態(tài)學(xué)和多基因序列分析進(jìn)行病原菌種級(jí)鑒定,比較了不同種間炭疽病菌的致病力、藥劑敏感性等生物學(xué)特性差異;以優(yōu)勢(shì)種山茶炭疽菌為材料,采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了山茶炭疽菌的遺傳多樣性;采用ATMT介導(dǎo)轉(zhuǎn)化進(jìn)行了角質(zhì)酶CaCUT1基因的敲除和互補(bǔ),研究了該基因在致病過(guò)程中的作用。主要研究結(jié)果如下:(1)從湖北、安徽、湖南、浙江、福建、江西、廣西和廣東8個(gè)省(自治區(qū))20個(gè)油茶園發(fā)病的油茶果實(shí)和葉片上分離獲得232個(gè)菌株。在致病性測(cè)定的基礎(chǔ)上,根據(jù)菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、分生孢子和附著胞形態(tài)等特征的差異,從232個(gè)菌株中鑒定出山茶炭疽菌(C.camelliae)、果生炭疽菌(C.fructicola)、暹羅炭疽菌(C.siamense)、隱秘炭疽菌(C.aenigma)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)5種病原菌。采用ITS、ACT、TUB2、CAL、CHS1和GAPDH基因序列聯(lián)合分析進(jìn)行分子鑒定,232個(gè)菌株被聚類成5個(gè)組,即C.camelliae聚類組、C.fructicola聚類組、C.siamense聚類組、C.aenigma聚類組和C.gloeosporioides聚類組,進(jìn)一步佐證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。232個(gè)炭疽菌中,山茶炭疽菌有170個(gè)菌株,占73.3%,屬于優(yōu)勢(shì)種群,在湖北、湖南、浙江、安徽、廣東、江西、福建和廣西等8省(自治區(qū))油茶上廣泛分布;該病菌以危害果實(shí)為主。果生炭疽菌有54株,占總菌株數(shù)的23.3%,在湖北、湖南、浙江、安徽、廣東、江西和廣西等7省(自治區(qū))廣泛分布,屬于葉片上炭疽菌優(yōu)勢(shì)種群,以危害葉片為主。暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌和膠孢炭疽菌的菌株數(shù)出現(xiàn)頻率較低。此外,還發(fā)現(xiàn)在同一田塊或同一棵油茶樹(shù)葉片和果實(shí)的炭疽病可以由相同種或不同種的炭疽菌引起。5個(gè)種的38個(gè)代表性菌株的致病力測(cè)定結(jié)果表明,炭疽菌種間致病力差異顯著,其中,山茶炭疽菌對(duì)油茶葉片和果實(shí)的致病力最強(qiáng)。不同種的炭疽菌對(duì)殺菌劑敏感性也存在顯著差異,對(duì)咪鮮胺表現(xiàn)最為敏感,而對(duì)多菌靈表現(xiàn)出不同程度的抗性。通過(guò)β-tubulin基因分析,山茶炭疽菌高抗菌株和抗性菌株的基因密碼子第198位由GAG變?yōu)镚CG,相應(yīng)氨基酸由谷氨酸(Glu)變?yōu)楸彼?Ala);中等抗性菌株的基因密碼子第200位由TTC變?yōu)門AC,相應(yīng)氨基酸由苯丙氨酸(Phe)變?yōu)槔野彼?Tyr)。(2)應(yīng)用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)山茶炭疽菌的遺傳多樣性的分析結(jié)果表明,在物種水平上,7個(gè)省16個(gè)地理種群的山茶炭疽菌的多態(tài)性條帶的百分比(PPB)為98.99%,Nei?s基因多樣性指數(shù)(H)為0.28,Shannon信息指數(shù)(I)為0.43,山茶炭疽菌具有豐富的遺傳多樣性,表明山茶炭疽菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中積累了較高的遺傳變異。遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,山茶炭疽菌在湖北省、浙江省、江西省、湖南省和廣西壯族自治區(qū)的地理種群內(nèi)存在不同程度的遺傳分化,5個(gè)省之間的種群間多樣性高于種群內(nèi)多樣性;在同一個(gè)省內(nèi),湖北地理種群間多樣性高于種群內(nèi)多樣性,而浙江、江西、湖南和廣西的地理種群內(nèi)多樣性高于種群間多樣性。從菌株的群體和個(gè)體聚類分析結(jié)果表明,菌株群體之間和個(gè)體之間都存在一定的遺傳變異,且菌株的遺傳多樣性與其地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性。(3)用特異性引物cutF和cutR擴(kuò)增山茶炭疽菌基因組DNA獲得角質(zhì)酶基因CaCUT1,該基因開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)度為727bp,含有52bp內(nèi)含子,與其它子囊菌門真菌的角質(zhì)酶基因具有較高的相似性;CaCUT1基因蛋白分子量為23.4 kDa;等電位點(diǎn)(pI)為6.58;蛋白序列的結(jié)構(gòu)域?yàn)閺?4個(gè)氨基酸到223個(gè)氨基酸。CaCUT1基因含有角質(zhì)酶基因所含有的-GYSQG-保守序列模塊,并且存在一個(gè)肽信號(hào),剪切位點(diǎn)位于第16個(gè)氨基酸與第17個(gè)氨基酸之間;含有α-螺旋和β-折疊片,且β-折疊片被α-螺旋包圍。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(ATMT)基因同源重組技術(shù),獲得山茶炭疽菌CaCUT1基因敲除轉(zhuǎn)化子和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子,敲除轉(zhuǎn)化子的角質(zhì)酶活性和致病力都有顯著降低;而互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶活性和致病性與野生型菌株無(wú)顯著差異,表明角質(zhì)酶基因CaCUT1在致病中起著重要作用。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S763.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2753777