發(fā)布時間：2020-07-13 17:44

【摘要】：炭疽病是我國油茶產(chǎn)區(qū)油茶上重要病害之一,嚴重影響了油茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前,關于油茶炭疽病的系統(tǒng)性研究報道較少。本文研究了我國油茶主產(chǎn)區(qū)油茶炭疽病的病原,根據(jù)形態(tài)學和多基因序列分析進行病原菌種級鑒定,比較了不同種間炭疽病菌的致病力、藥劑敏感性等生物學特性差異;以優(yōu)勢種山茶炭疽菌為材料,采用ISSR分子標記技術研究了山茶炭疽菌的遺傳多樣性;采用ATMT介導轉(zhuǎn)化進行了角質(zhì)酶CaCUT1基因的敲除和互補,研究了該基因在致病過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:(1)從湖北、安徽、湖南、浙江、福建、江西、廣西和廣東8個省(自治區(qū))20個油茶園發(fā)病的油茶果實和葉片上分離獲得232個菌株。在致病性測定的基礎上,根據(jù)菌落形態(tài)、生長速率、分生孢子和附著胞形態(tài)等特征的差異,從232個菌株中鑒定出山茶炭疽菌(C.camelliae)、果生炭疽菌(C.fructicola)、暹羅炭疽菌(C.siamense)、隱秘炭疽菌(C.aenigma)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)5種病原菌。采用ITS、ACT、TUB2、CAL、CHS1和GAPDH基因序列聯(lián)合分析進行分子鑒定,232個菌株被聚類成5個組,即C.camelliae聚類組、C.fructicola聚類組、C.siamense聚類組、C.aenigma聚類組和C.gloeosporioides聚類組,進一步佐證了形態(tài)學鑒定結(jié)果。232個炭疽菌中,山茶炭疽菌有170個菌株,占73.3%,屬于優(yōu)勢種群,在湖北、湖南、浙江、安徽、廣東、江西、福建和廣西等8省(自治區(qū))油茶上廣泛分布;該病菌以危害果實為主。果生炭疽菌有54株,占總菌株數(shù)的23.3%,在湖北、湖南、浙江、安徽、廣東、江西和廣西等7省(自治區(qū))廣泛分布,屬于葉片上炭疽菌優(yōu)勢種群,以危害葉片為主。暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌和膠孢炭疽菌的菌株數(shù)出現(xiàn)頻率較低。此外,還發(fā)現(xiàn)在同一田塊或同一棵油茶樹葉片和果實的炭疽病可以由相同種或不同種的炭疽菌引起。5個種的38個代表性菌株的致病力測定結(jié)果表明,炭疽菌種間致病力差異顯著,其中,山茶炭疽菌對油茶葉片和果實的致病力最強。不同種的炭疽菌對殺菌劑敏感性也存在顯著差異,對咪鮮胺表現(xiàn)最為敏感,而對多菌靈表現(xiàn)出不同程度的抗性。通過β-tubulin基因分析,山茶炭疽菌高抗菌株和抗性菌株的基因密碼子第198位由GAG變?yōu)镚CG,相應氨基酸由谷氨酸(Glu)變?yōu)楸彼?Ala);中等抗性菌株的基因密碼子第200位由TTC變?yōu)門AC,相應氨基酸由苯丙氨酸(Phe)變?yōu)槔野彼?Tyr)。(2)應用ISSR-PCR分子標記技術對山茶炭疽菌的遺傳多樣性的分析結(jié)果表明,在物種水平上,7個省16個地理種群的山茶炭疽菌的多態(tài)性條帶的百分比(PPB)為98.99%,Nei?s基因多樣性指數(shù)(H)為0.28,Shannon信息指數(shù)(I)為0.43,山茶炭疽菌具有豐富的遺傳多樣性,表明山茶炭疽菌在長期進化過程中積累了較高的遺傳變異。遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,山茶炭疽菌在湖北省、浙江省、江西省、湖南省和廣西壯族自治區(qū)的地理種群內(nèi)存在不同程度的遺傳分化,5個省之間的種群間多樣性高于種群內(nèi)多樣性;在同一個省內(nèi),湖北地理種群間多樣性高于種群內(nèi)多樣性,而浙江、江西、湖南和廣西的地理種群內(nèi)多樣性高于種群間多樣性。從菌株的群體和個體聚類分析結(jié)果表明,菌株群體之間和個體之間都存在一定的遺傳變異,且菌株的遺傳多樣性與其地理來源無明顯相關性。(3)用特異性引物cutF和cutR擴增山茶炭疽菌基因組DNA獲得角質(zhì)酶基因CaCUT1,該基因開放閱讀框序列長度為727bp,含有52bp內(nèi)含子,與其它子囊菌門真菌的角質(zhì)酶基因具有較高的相似性;CaCUT1基因蛋白分子量為23.4 kDa;等電位點(pI)為6.58;蛋白序列的結(jié)構(gòu)域為從44個氨基酸到223個氨基酸。CaCUT1基因含有角質(zhì)酶基因所含有的-GYSQG-保守序列模塊,并且存在一個肽信號,剪切位點位于第16個氨基酸與第17個氨基酸之間;含有α-螺旋和β-折疊片,且β-折疊片被α-螺旋包圍。利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化(ATMT)基因同源重組技術,獲得山茶炭疽菌CaCUT1基因敲除轉(zhuǎn)化子和互補轉(zhuǎn)化子,敲除轉(zhuǎn)化子的角質(zhì)酶活性和致病力都有顯著降低;而互補轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶活性和致病性與野生型菌株無顯著差異,表明角質(zhì)酶基因CaCUT1在致病中起著重要作用。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S763.7

【參考文獻】

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本文編號：2753777