【摘要】：近年來藥用植物病毒病發(fā)生逐年加重,寄生性強、致病力大、傳染性高,已經(jīng)成為影響藥用植物生長的主要限制因子之一。但是藥用植物病毒病的研究還很不完善,發(fā)生情況不詳,病原不明,難以指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。本研究旨在對常見藥用植物病毒病發(fā)生情況做初步調(diào)查和病原鑒定,為藥用植物病毒病的防治和進一步研究奠定基礎(chǔ)。采用RT-PCR方法結(jié)合生物學(xué)檢測和一代測序技術(shù),研究了人參、西洋參、羅漢果、菊花、白術(shù)、太子參、寧夏枸杞、薄荷、曼陀羅和牛蒡10種藥用植物的病毒病發(fā)生情況和病毒侵染情況。在地黃、羅漢果、菊花、太子參、薄荷和曼陀羅上檢測到病毒侵染,并將病原病毒鑒定到了種或?qū)�。另�?在檢測基礎(chǔ)上構(gòu)建完善了針對藥用植物病毒病的RT-PCR檢測體系,為后續(xù)大范圍開展藥用植物病毒病調(diào)查提供了技術(shù)支持。高通量測序發(fā)現(xiàn),表現(xiàn)矮化癥狀的菊花樣品中含有與Carlavirus屬病毒相似度較高的病毒。借助RT-PCR和RACE技術(shù),克隆了目的病毒的全基因組序列,確定其為Carlavirus屬的一種新病毒,命名為菊花R病毒(Chrysanthemum virus R,CVR)。CVR的基因組全長為8,874nt(不包括poly(A)尾),編碼6個開放閱讀框。田間調(diào)查數(shù)據(jù)表明,菊花栽培過程中接近半數(shù)的樣品被CVR侵染,其為害情況高于菊花常見病毒CVB。田間調(diào)查時發(fā)現(xiàn)有表現(xiàn)病毒花葉癥狀的菘藍植株,用RT-PCR方法檢測到其被黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)侵染。通過對CMV菘藍分離物CP基因序列的擴增和特征分析,明確了其屬于CMVⅠ亞組。這是首次用分子生物學(xué)方法確定CMV可以侵染菘藍,對菘藍花葉病綜合有效的防控具有重要意義。2016年秋季和2017年春季分別采集毛花洋地黃樣品,經(jīng)生物學(xué)檢測和RT-PCR分子生物學(xué)檢測,秋季樣品被CMV和甜菜西部黃化病毒(Beet Western Yellow Virus,BWYV)復(fù)合侵染,春季樣品被蠶豆萎蔫病毒2號(Broad bean wilt virus2,BBWV2)和油菜花葉病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)復(fù)合侵染。設(shè)計特異引物進行RT-PCR克隆了 BWYV-毛花洋地黃分離物、BBWV2-毛花洋地黃分離物和YoMV-毛花洋地黃分離物的部分序列信息。這是首次用生物學(xué)和分子生物學(xué)方法,在毛花洋地黃病毒病樣品上分別檢測到了 CMV和BWYV及BBWV2和YoMV的復(fù)合侵染。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.67
【圖文】：

３．２．１．１檢測樣品逡逑２０１７年２月北京市植保站提供的４份菊花樣品，分別編號為ＪＨ－１？４，均表現(xiàn)逡逑矮化癥狀，ＪＨ－３同時表現(xiàn)矮化和黃化癥狀（圖３－１）。逡逑漏＿逡逑ＪＨ－１邐ＪＨ－２逡逑ｍｍ逡逑ＪＨ邋－３邐ＪＨ－４逡逑圖３－１菊花病毒病癥狀圖逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ邋ｖｉｒｕｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ逡逑

ＲＴ－ＰＣＲ邋檢測病毒：ＣＭＶ、Ｐｏｚｙｗ－ｍｓ１、ＣＳＶｄ邋和邋ＣＶＢ。逡逑ＲＴ－ＰＣＲ檢測：采用ＴＲＮｚｏｌ法（具體方法參照第二章）分別提取菊花樣品葉片逡逑總ＲＮＡ，對樣品的總ＲＮＡ電泳，從電泳圖（圖３－２）中可觀察到ｒＲＮＡ條帶，表明逡逑４個樣品的總ＲＮＡ提取成功。逡逑１邐２邐３邐４邋Ｍ逡逑注：２，０００邋ＲＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？４：菊花樣品邋１邋？４逡逑圖３－２菊花樣品總ＲＮＡ電泳圖逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑ＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果顯示，ＣＶＢ的特異檢測引物ＣＶＢ－Ｕ／ＣＶＢ－Ｌ在ＪＨ－４樣品中擴增逡逑到與陽性對照大小一致的條帶，ＣＳＶｄ特異檢測引物ＣＳＶｄ－２０８Ｆ／ＣＳＶｄ－２０７Ｒ在ＪＨ－逡逑１和ＪＨ－３樣品中擴增到與陽性對照大小一致的條帶（圖３－３）。逡逑邐ＣＶＢ邐邋邐ＣＶＳｄ邐逡逑１２３４５６７８９邐１０邋Ｍ逡逑７５０邋ｂｐ逡逑丨、＇邐Ｂ＾－５００邋ｂｐ逡逑■？—２５０邋ｂｐ逡逑注：Ｍ：邋２，０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；邋１、６：邋ＪＨ－１；邋２、７：邋ＪＨ－２；邋３、８：邋ＪＨ－３；邋４、９：邋ＪＨ＿４；邋５、１０：陰逡逑性對照；逡逑

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【參考文獻】

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本文編號：2753360