【摘要】：葡萄是世界重要的栽培果樹之一,歐洲葡萄品種是主栽品種。葡萄白粉病是嚴重危害葡萄生產(chǎn)的主要真菌病害之一,病害的流行往往會帶來巨大的經(jīng)濟損失。利用葡萄抗病種質(zhì)資源培育抗白粉病新品種是提高歐洲葡萄品種抗病性的有效方法。項目組前期的研究表明中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’中白藜蘆醇含量高,對白粉病具有較高的抗性,挖掘其抗病基因?qū)μ岣邭W洲葡萄抗病性與品質(zhì)具有十分重要的意義。本研究從‘丹鳳-2’葡萄中克隆得到VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因序列,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入抗病性弱的歐洲葡萄無核白中,進行抗白粉病功能分析。主要得到的結(jié)果如下:1.中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’芪合成酶基因VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25受生物與非生物脅迫誘導(dǎo)表達,并響應(yīng)白粉菌及非生物脅迫誘導(dǎo)與刺激,表達上調(diào)。這3個芪合成酶基因在接種白粉菌后12 h表達量顯著上升,分別達到了為對照的38.2倍、54.15倍和103.4倍,其次在96 h至120 h表達量較高。在其他生物小分子化合物MeJA、SA、ABA和非生物類因子創(chuàng)傷、低溫、鹽、干旱脅迫處理下表達上調(diào),其中VqSTS12基因和VqSTS24基因?qū)Φ蜏靥幚碜蠲舾?VqSTS25基因?qū)?chuàng)傷處理最敏感。2.利用同源序列克隆技術(shù)獲得編碼區(qū)序列長度均為1179 bp的VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因,編碼392個氨基酸,均定位于16號染色體。序列分析發(fā)現(xiàn)在歐洲葡萄‘PN40024’中的同源基因分別為VvSTS31、VvSTS43和VvSTS39。亞細胞定位結(jié)果表明這3個芪合成酶定位在細胞質(zhì)中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入歐洲葡萄無核白愈傷組織,共得到304個轉(zhuǎn)VqSTS12基因無核白抗性苗,275個轉(zhuǎn)VqSTS24基因無核白抗性苗,224個轉(zhuǎn)VqSTS25基因無核白抗性苗。經(jīng)PCR及Western blot檢測最終得到7個轉(zhuǎn)VqSTS12基因無核白植株,陽性率為2.30%;5個轉(zhuǎn)VqSTS25基因無核白植株,陽性率為2.23%;轉(zhuǎn)VqSTS24基因無核白抗性苗在Western blot檢測中未檢測到明顯條帶。3.轉(zhuǎn)基因植株實時定量PCR分析與高效液相色譜(HPLC)檢測,發(fā)現(xiàn)與野生型植株相比轉(zhuǎn)基因植株中芪合成酶(STS)基因與下游白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶(RSGT)基因的表達升高,STS的底物競爭酶查爾酮合成酶(CHS)基因表達降低。STS基因的表達產(chǎn)物中芪類物質(zhì)主要是反式云杉新苷含量顯著增加,其中VqSTS12過表達的OE-L7植株糖苷含量最高(135.19μg?g~(-1) Dw),是野生型植株的14.84倍。表明轉(zhuǎn)基因植株中過量表達的VqSTS12和VqSTS25基因參與了白藜蘆醇的合成。4.接種白粉菌后比較無核白葡萄轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株對白粉菌的抗性。表型觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對白粉菌的敏感性降低,菌絲發(fā)育遲緩,部分孢子萌發(fā)受抑制。轉(zhuǎn)基因植株中VqSTS12和VqSTS25基因受白粉菌誘導(dǎo)表達顯著增加,接菌后1~3 d表達量上升,是野生型植株的83~112倍,接種第6~7 d表達量再次上升。同時檢測到其表達產(chǎn)物白藜蘆醇、云杉新苷、葡萄素與紫檀芪含量顯著增加。較野生型植株發(fā)病較晚,病情較輕。表明轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株抗白粉病。5.干旱脅迫處理下轉(zhuǎn)基因無核白植株中芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25受干旱脅迫誘導(dǎo)表達增加,丙二醛含量、過氧化物酶活性和過氧化氫酶活性等生理指標(biāo)均優(yōu)于野生型無核白植株,表現(xiàn)出了一定的抗干旱能力。上述研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)VqSTS12和VqSTS25基因無核白植株中芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25不僅對非生物脅迫處理后表達,而且對接種白粉菌的表達也是增強的。因此,中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’芪合成酶基因VqSTS12和VqSTS25可以作為改良歐洲葡萄品種的抗性基因,中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’是抗病育種的種質(zhì)資源。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S436.631
【圖文】：

第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析3.1 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 白粉菌誘導(dǎo)條件下表達分析為了分析中國野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在葡萄粉菌誘導(dǎo)條件下的表達模式，對毛葡萄‘丹鳳-2’葉片進行接種白粉菌處理。實時定PCR 結(jié)果表明 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 基因均受白粉菌誘導(dǎo)表達（圖 3-1）VqSTS12 基因在處理后 12 h 表達量顯著上升，為對照的 38.2 倍，隨后表達量下降，處理后 96 h 至 120 h 表達量又回到一個較高的水平。VqSTS24 基因和 VqSTS25 基因應(yīng)白粉菌誘導(dǎo)表達模式與 VqSTS12 基因類似，但表達強度不同。VqSTS24 基因在處后 12 h 表達量為對照的 54.15 倍，VqSTS25 基因在處理后 12 h 表達量為對照的 103倍。在自然狀態(tài)下，這三個芪合成酶基因的表達水平波動較小。

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 生物脅迫條件下表達分析為了分析中國野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在生物脅迫條件下的表達模式，對毛葡萄‘丹鳳-2’葉片進行外源生物小分子化合物誘導(dǎo)處理，包括茉莉酮酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）和乙烯利（Eth）。實時定量 PCR 結(jié)果表明 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 基因均受 MeJA、SA 和 ABA 誘導(dǎo)表達，不響應(yīng) Eth 的誘導(dǎo)（圖 3-2）。VqSTS12 基因?qū)?ABA 和 MeJA 處理敏感，其中 ABA處理后 3 h 表達顯著上升，達到對照的 8.27 倍；MeJA 處理后 24 h 達到高峰，為對照的 6.9 倍。VqSTS24 基因響應(yīng) ABA 和 SA 誘導(dǎo)，其表達水平呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，其中 SA 處理后表達強度與響應(yīng)速度高于 ABA 處理；VqSTS25 基因?qū)?ABA 處理最敏感，處理后 3 ~ 48 h 是高表達時期。

qRT-PCR analysis of the expression of STS genes under 100 μM MeJA(A), 100 μM SA(B), 100 μMABA(C) and 100 μM Ethylene (D). Samples were collected at 0, 0.5, 3, 6, 12, 24 and 48 h（*P ＜0.05,**P ＜0.01）.3.3 毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 非生物脅迫條件下表達分析為了分析中國野生毛葡萄芪合成酶基因 VqSTS12、VqSTS24 和 VqSTS25 在非生物脅迫條件下的表達模式，對毛葡萄‘丹鳳-2’葉片進行創(chuàng)傷、低溫、鹽和干旱共 4 個處理。實時定量 PCR 結(jié)果表明這 3 個芪合成酶基因高度受非生物脅迫誘導(dǎo)表達（圖 3-3）。VqSTS12 基因受所有處理誘導(dǎo)表達上升，處理后 0.5 ~ 24h 為高表達時期，在低溫處理后 48 h 達到最高值，為對照的 22 倍。VqSTS24 基因?qū)?chuàng)傷、低溫和干旱處理敏感，尤其是低溫處理 24h 時，表達量達到了最高值，為對照的 41 倍。VqSTS25 基因?qū)?chuàng)傷處理最敏感，處理后 6 h 表達量最高，達到對照的 27 倍；在低溫、鹽及干旱誘導(dǎo)處理 6h后表現(xiàn)出高表達趨勢。

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本文編號：2749402