【摘要】：隨著分子生物學(xué)不斷的發(fā)展以及miRNA的功能發(fā)現(xiàn),對(duì)于植物抗逆研究又有了新的突破口。在模式植物擬南芥中miR164調(diào)控植物的葉片和側(cè)根發(fā)育及病原菌等非生物與生物脅迫。近幾年來(lái),逐漸展開了棉花mi RNA調(diào)控機(jī)制的研究,有關(guān)miR164調(diào)控棉花生理生化方面的報(bào)道越來(lái)越多,但有關(guān)miRNA調(diào)控棉花抗病性及其機(jī)制分析研究罕有報(bào)道。WRKY蛋白是最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占有舉足輕重的地位,有關(guān)棉花抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究已經(jīng)有一些報(bào)道。然而,棉花中WRKY蛋白參與抗病反應(yīng)等分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究對(duì)miR164及其靶基因GhNAC100和GhWRKY22參與棉花抗黃萎病性進(jìn)行了研究,取得主要結(jié)果如下:1.通過sRNA組學(xué)和降解組測(cè)序數(shù)據(jù)分析,篩選出黃萎病病原菌(大麗輪枝菌,Verticillium dahliae)誘導(dǎo)表達(dá)差異顯著的miR164及其預(yù)測(cè)靶基因GhNAC100。其表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證表明,在棉花接菌7 d后miR164表達(dá)顯著下降,而靶基因GhNAC100表達(dá)呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。2.克隆了GhNAC100的全長(zhǎng)基因及miR164的前體pre-miR164;構(gòu)建了過表達(dá)載體pBI121-NACW、pBI-121-pre-miR164、pBI-121-NACM,并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明了miR164能夠降解其靶基因GhNAC100的mRNA,具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。3.對(duì)棉花進(jìn)行V.dahliae侵菌處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接菌后GhNAC100的表達(dá)受到顯著地誘導(dǎo);并分析了茉莉酸甲酯(MeJA)與水楊酸(SA)兩種激素誘導(dǎo)下GhNAC100的表達(dá),結(jié)果顯示GhNAC100響應(yīng)SA和JA信號(hào)途徑的誘導(dǎo)。4.構(gòu)建了GhNAC100基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體pYL-156-GNAC,將其轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌GV3101中,注射棉花子葉獲得GhNAC100基因沉默植株。對(duì)這些沉默植株接種V.dahliae并進(jìn)行抗性分析,結(jié)果表明棉花GhNAC100沉默植株更易感病,V.dahliae病原菌回復(fù)率相對(duì)于對(duì)照顯著提高。在GhNAC100沉默植株接菌72 h后,SA和JA抗病標(biāo)志基因PR1、PDF1.2表達(dá)水平顯著低于對(duì)照植株,暗示GhNAC100基因可能通過SA和JA信號(hào)途徑參與棉花對(duì)V.dahliae的抗性。5.利用生物信息學(xué)篩選出8個(gè)與擬南芥直系同源的棉花抗病相關(guān)WRKY基因,其對(duì)V.dahliae誘導(dǎo)呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式,其中GhWRKY22表達(dá)顯著響應(yīng)病原菌的誘導(dǎo)。在MeJA和SA的處理下,GhWRKY22基因表達(dá)顯著上升,暗示該基因受到SA和JA信號(hào)途徑的調(diào)控參與棉花抗病反應(yīng)。6.利用植物病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)技術(shù)獲得Gh WRKY22沉默棉花植株,該基因表達(dá)量被沉默了60%以上。對(duì)沉默植株接種V.dahlia,結(jié)果顯示基因沉默植株表現(xiàn)為對(duì)病原菌侵染更敏感,發(fā)病率與病值、病原菌回復(fù)率均明顯高于對(duì)照組。同時(shí),分析抗病標(biāo)志基因PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1.2表達(dá)情況,結(jié)果顯示這些抗病標(biāo)志基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株,揭示了Gh WRKY22基因是通過SA和JA信號(hào)途徑參與棉花對(duì)V.dahliae的抗性。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S435.62
【圖文】：

因 GhNAC100 兩者之間存在著顯著的負(fù)相關(guān)圖 1 目的片段 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳ose electrophoresis of extraction of PCR products oker；A1：GhNAC100 基因 PCR 產(chǎn)物； B1：GNAC GhNACM 基因 PCR 產(chǎn)物；D1：pre-miR164 基因kers; A1: PCR products of gene GhNAC100; B1: PCroducts of gene GhNACW and GhNACM; D1: PC

圖 1 目的片段 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose electrophoresis of extraction of PCR products of target gen：DL2 000 DNA marker；A1：GhNAC100 基因 PCR 產(chǎn)物； B1：GNAC100 基因 P；C1：GhNACW 與 GhNACM 基因 PCR 產(chǎn)物；D1：pre-miR164 基因 PCR 產(chǎn)物: DL2 000 DNA markers; A1: PCR products of gene GhNAC100; B1: PCR products AC100; C1: PCR products of gene GhNACW and GhNACM; D1: PCR products oe-miR164.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 盧秀茹;賈肖月;牛佳慧;;中國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2018年01期

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本文編號(hào)：2735648