【摘要】：黃瓜(Cucumis sativus L.)是我國(guó)設(shè)施園藝生產(chǎn)中主要蔬菜作物之一。黃瓜棒孢葉斑病是由致病真菌多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的一種世界范圍的真菌病害,嚴(yán)重危害我國(guó)黃瓜生產(chǎn)。目前關(guān)于黃瓜抗棒孢葉斑病的作用機(jī)制尚不完全清楚。對(duì)棒孢葉斑病菌誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究,將有助于從分子水平上直接了解黃瓜應(yīng)答病原菌侵染所啟動(dòng)的基因功能,揭示黃瓜防御反應(yīng)的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制,為植物抗病育種工作及植物病害的防御和控制等提供理論依據(jù)。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),研究了接種棒孢葉斑病菌后抗病黃瓜品種津優(yōu)38號(hào)轉(zhuǎn)錄組和microRNA的變化,鑒定到響應(yīng)棒孢葉斑病菌侵染的關(guān)鍵miRNAs和差異表達(dá)基因;并利用黃瓜瞬時(shí)過(guò)表達(dá)技術(shù)和TRV誘導(dǎo)的STTM-miRNA沉默技術(shù)等手段,進(jìn)一步證實(shí)這些關(guān)鍵miRNAs及其靶基因在黃瓜防御棒孢葉斑病菌侵染中的作用,揭示木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物快速合成積累是黃瓜抗棒孢葉斑病的重要機(jī)制之一。主要研究結(jié)果如下:(1)通過(guò)對(duì)多個(gè)品種的黃瓜接種棒孢葉斑病進(jìn)行抗病性鑒定,篩選出津優(yōu)38號(hào)屬于高抗品種,而露地先鋒為感病品種。利用PCR技術(shù)對(duì)接種棒孢葉斑病后抗、感品種黃瓜葉片進(jìn)行病原菌快速檢測(cè),最早可以在接種后6 h在所有品種葉片組織中檢測(cè)到入侵的棒孢葉斑病菌。對(duì)接種棒孢葉斑病菌后的抗、感品種黃瓜葉片進(jìn)行活性氧和木質(zhì)素組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)在接種后6 h到24 h時(shí),抗病品種中的木質(zhì)素和活性氧含量要明顯高于感病品種,可以更快速響應(yīng)病原菌的脅迫。(2)對(duì)抗病品種黃瓜津優(yōu)38號(hào)接種棒孢葉斑病菌0 h、6 h和24 h的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)多時(shí)間點(diǎn)比較(0 hpi vs 6 hpi和6 hpi vs 24 hpi)篩選差異表達(dá)基因,兩組交集中共有146個(gè)差異基因。從這些差異基因中選取了17個(gè)可能與黃瓜響應(yīng)棒孢葉斑病菌侵染有關(guān)的基因進(jìn)行歸類(lèi),這些基因涉及了植物激素、轉(zhuǎn)錄因子、代謝、Ca~(2+)信號(hào)通路、次生代謝相關(guān)和防御類(lèi)基因。同時(shí),利用qRT-PCR方法分析黃瓜抗、感品種之間的基因差異表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)在抗病品種津優(yōu)38號(hào)中次生代謝相關(guān)的基因會(huì)被棒孢葉斑病菌強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)。(3)miRNA測(cè)序共鑒定了34個(gè)差異表達(dá)的已知miRNAs,它們分屬于17個(gè)不同的miRNA家族。結(jié)合黃瓜基因組信息和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),并根據(jù)靶基因功能進(jìn)一步篩選出8個(gè)可能與抗黃瓜棒孢葉斑病相關(guān)的miRNAs;同時(shí),鑒定了7個(gè)可能與抗病相關(guān)的新miRNAs,這些新預(yù)測(cè)miRNAs的靶基因均為轉(zhuǎn)錄組分析中的差異表達(dá)基因,且多與次生代謝有關(guān)。(4)通過(guò)In-fusion技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體,并利用煙草GUS染色驗(yàn)證了miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7對(duì)其相應(yīng)的靶基因NAC、APE、4CL和PAL的負(fù)調(diào)控關(guān)系。在黃瓜子葉中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后接種棒孢葉斑病菌觀(guān)察表型,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NAC、APE、4CL和PAL可以提高黃瓜抗病性,過(guò)表達(dá)miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7會(huì)降低黃瓜的抗病性。木質(zhì)素測(cè)定結(jié)果表明過(guò)表達(dá)4CL和PAL會(huì)提高黃瓜木質(zhì)素含量,而過(guò)表達(dá)Novel-miR1和Novel-miR7會(huì)降低木質(zhì)素含量,說(shuō)明Novel-miR1和Novel-miR7對(duì)4CL和PAL的調(diào)控會(huì)影響木質(zhì)素含量進(jìn)而影響黃瓜的抗病性。(5)成功構(gòu)建了TRV誘導(dǎo)的STTM-miRNA沉默載體,并對(duì)目標(biāo)miRNA進(jìn)行沉默,抗病性鑒定和活性氧及木質(zhì)素代謝相關(guān)的生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明,沉默候選miRNAs可以提高黃瓜抗病性。其中沉默Novel-miR1和Novel-miR7的株系中木質(zhì)素含量有顯著上調(diào),再次驗(yàn)證Novel-miR1-4CL和Novel-miR7-PAL能通過(guò)調(diào)控黃瓜木質(zhì)素含量變化而影響黃瓜對(duì)棒孢葉斑病的抗性。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S436.421.1
【圖文】：

圖 1-1 植物 miRNAs 的生物合成示意圖Fig. 1-1 Biogenesis mechanism of plant miRNAs物中的作用機(jī)制具有多種生物學(xué)功能，可以參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)應(yīng)答等。植物中 miRNAs 的作用機(jī)制一般存在兩mallinterferingRNAs,siRNAs）相似，植物 miRN5’端殘基可以和靶 mRNA 的開(kāi)放讀碼框（open r互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行切割降解，從而使靶 mRNA 無(wú)法（Johnson et al., 2005; Khraiwesh et al., 2012; 伊六NAs 與靶 mRNA 結(jié)合不完全匹配，進(jìn)而抑制 mRck et al., 2000）。在 miRNAs 抑制翻譯過(guò)程中，ntranslatedregion,UTR）結(jié)合并改變 mRNA 上核鏈來(lái)抑制 mRNA 的翻譯。也有研究發(fā)現(xiàn)植物 mi和靶基因 APETALA2 的 ORF 區(qū)完全互補(bǔ)，但并不LA2 的翻譯抑制，說(shuō)明 miRNAs 作用機(jī)制中的切

技術(shù)路線(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2734925