【摘要】：飛蝗(Locusta migratoria)是重要農(nóng)業(yè)害蟲,每頭雌蝗可產(chǎn)卵300-400粒,強(qiáng)大的生殖力是蝗災(zāi)形成的關(guān)鍵因素之一。昆蟲的卵黃發(fā)生(vitellogenesis)為發(fā)育中的卵母細(xì)胞提供充足的卵黃蛋白等營養(yǎng)物質(zhì),保障了大量的卵成熟和胚胎發(fā)育所需的物質(zhì)和能量。卵黃發(fā)生是卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)在脂肪體中合成,通過血淋巴和卵泡細(xì)胞間的通道(patency)運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞,最終被卵母細(xì)胞吸收儲存的過程。在以飛蝗為代表的許多昆蟲中,卵黃發(fā)生由咽側(cè)體分泌的保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控。JH誘導(dǎo)卵泡細(xì)胞胞間通道開啟以促進(jìn)Vg順利運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞是昆蟲生殖調(diào)控的關(guān)鍵進(jìn)程之一,然而其中的分子機(jī)制還有待闡明。本論文利用免疫熒光、Co-IP、Western blot、RNAi等細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的方法,以飛蝗卵泡細(xì)胞黏連結(jié)構(gòu)為切入點,鑒定參與JH調(diào)節(jié)胞間通道的關(guān)鍵細(xì)胞黏連因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,闡明JH通過調(diào)控細(xì)胞黏連誘導(dǎo)胞間通道開啟的分子機(jī)制,為害蟲綠色防控提供分子靶標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:1.飛蝗卵泡細(xì)胞以黏著小帶(zonula adherens)兩兩間相互黏附形成緊密的單細(xì)胞層包被卵母細(xì)胞。通過免疫熒光觀察體內(nèi)黏著小帶核心蛋白β-catenin的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),隨著胞間通道增大,β-catenin定位逐漸收縮。β-catenin僅定位于細(xì)胞間黏連的區(qū)域,而胞間通道區(qū)域無β-catenin定位。體外JH誘導(dǎo)胞間通道開啟,發(fā)現(xiàn)β-catenin定位也隨著胞間通道的開啟而變化,與體內(nèi)實驗結(jié)果相似。根據(jù)上述結(jié)果推測,黏著小帶在JH誘導(dǎo)的胞間通道開啟過程中發(fā)生解聚。2.體內(nèi)注射dsRNA干擾Par3(partitioning-defective protein3)、調(diào)節(jié)Par3磷酸化的蛋白Par6、或aPKC(atypical protein kinase C),能夠破壞卵泡細(xì)胞間的黏連,導(dǎo)致卵泡細(xì)胞彼此分離,表型與β-catenin RNAi的表型相似。表明Par3、Par6和aPKC不但維系黏著小帶結(jié)構(gòu),也在JH誘導(dǎo)的胞間通道中發(fā)揮作用。Co-IP實驗表明,JH誘導(dǎo)條件下,β-catenin和Par3的結(jié)合顯著減弱,暗示JH促進(jìn)黏著小帶的解聚并誘導(dǎo)胞間通道。磷酸化aPKC在卵泡細(xì)胞中僅定位在胞間通道區(qū)域,而細(xì)胞間黏連的區(qū)域檢測不到磷酸化aPKC信號,推測aPKC參與了胞間通道的調(diào)控過程。在體外條件下利用aPKC特異性抑制劑ACPD處理卵黃發(fā)生期的卵泡細(xì)胞,能夠顯著抑制JH誘導(dǎo)的胞間通道。此外,aPKC和Par6上游信號因子Cdc42的特異性抑制劑ML141同樣能夠抑制JH誘導(dǎo)的胞間通道開啟。這些結(jié)果說明,Cdc42、aPKC、Par3、Par6參與JH誘導(dǎo)的胞間通道。Western blot顯示,JH誘導(dǎo)aPKC和Par3磷酸化,而ACPD和ML141抑制JH誘導(dǎo)的aPKC和Par3磷酸化。綜合上述結(jié)果,JH可能通過Cdc42、Par6、aPKC通路觸發(fā)Par3磷酸化,磷酸化的Par3與β-catenin分離,導(dǎo)致黏著小帶的解聚和胞間通道開啟。3.使用G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)抑制劑suramin、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine receptor,RTK)抑制劑genistein和Su6668處理卵黃發(fā)生期卵泡細(xì)胞并進(jìn)行JH誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)suramin能夠顯著抑制JH誘導(dǎo)胞間通道,而genistein和Su6668的處理對胞間通道沒有明顯影響,表明GPCR參與JH調(diào)控的胞間通道。綜合本論文的研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)β-catenin主導(dǎo)的黏著小帶在JH誘導(dǎo)的胞間通道中起重要作用,JH可能通過GPCR、Cdc42、Par6、aPKC信號通路觸發(fā)Par3磷酸化,磷酸化的Par3與β-catenin分離,導(dǎo)致黏著小帶的解聚,從而誘導(dǎo)胞間通道。研究結(jié)果對闡明JH調(diào)控卵黃發(fā)生的分子機(jī)制具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433
【圖文】：

圖 3-1 飛蝗卵黃發(fā)生期的卵泡細(xì)胞的β-catenin 亞細(xì)胞定位卵母細(xì)胞正常發(fā)育階段，左側(cè)分別是首卵長度為 1.2mm、1.8mm、2.4mm、3.6mm、4.8mm 和6.0mm 的卵小管照片，比例尺=1mm。右側(cè)是對應(yīng)的卵母細(xì)胞卵泡細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和β-catenin 亞細(xì)胞定位。隨著首卵發(fā)育，卵泡上皮細(xì)胞胞間通道逐漸增大，β-catenin 在細(xì)胞間連接處逐漸減少的亞細(xì)胞定位變化。藍(lán)色是 Hoeschst 33342 染色指示細(xì)胞核；綠色是 AlexaFlour 488 Phalloidin 染色 F-actin 指示細(xì)胞膜；紅色是免疫熒光染色，指示 β-catenin 定位。3.1.2 JH 誘導(dǎo)飛蝗卵泡細(xì)胞胞間通道的開啟我們使用 40% Basal Medium Eagle (BME) + 60%Schneider's DrosophilaMedium 的混合培養(yǎng)基對剖出蟲體外的卵小管進(jìn)行體外培養(yǎng)，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中恒溫 33℃，卵小管在此培養(yǎng)基中可存活 10 天，生理活性良好。(DaveyandHuebner,1974)。我們使用 JHIII 誘導(dǎo)卵泡細(xì)胞，對照組只加入等體積的 JH 溶劑乙醇。同

圖 3-2 JH III 誘導(dǎo)胞間通道開啟泡細(xì)胞的對照組 Ctrl 和處理組 10-8M JH III 誘導(dǎo) 1h 后的CellMask 橙色指示卵泡細(xì)胞的活細(xì)胞細(xì)胞膜。比例尺=5的胞間通道面積的統(tǒng)計圖。H 誘導(dǎo)后 β-catenin 的亞細(xì)胞定位發(fā)生期的雌蟲卵巢，解剖卵小管，對卵母細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)注 β-catenin 的定位，對細(xì)胞膜和細(xì)胞核染色觀察和成像，可以看到在 JH III 誘導(dǎo)后，胞間通存在于細(xì)胞之間的細(xì)胞膜連接處，β-catenin 在 JH化（圖 3-3）。 綜合上述結(jié)果，推測黏著小帶結(jié)構(gòu)在胞間彼此分離，為胞間通道開啟和增大條件。

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本文編號：2733990