【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)葉銹病由�；苑浅�(qiáng)的活體寄生真菌葉銹菌(Puccinia triticina)侵染引起,其爆發(fā)年代導(dǎo)致小麥大量減產(chǎn),嚴(yán)重威脅糧食安全。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事小麥抵抗葉銹菌侵染的分子機(jī)制研究,在不親和組合中,小麥通過過敏性反應(yīng)-程序性細(xì)胞死亡(hypersensitive reaction-PCD,HR-PCD)來(lái)抑制葉銹菌的發(fā)育。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),小麥翻譯控制腫瘤蛋白(TaTCTP)能夠響應(yīng)葉銹菌侵染,并參與HR-PCD的形成過程,對(duì)發(fā)生HR-PCD的細(xì)胞死亡進(jìn)程具有正調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究TaTCTP在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的作用機(jī)制,本課題組前期借助TAP(串聯(lián)親和純化)與質(zhì)譜聯(lián)用,鑒定出一個(gè)Ser/Thr蛋白激酶,可能作為TaTCTP的潛在互作蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該蛋白激酶屬于蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)家族,與SnRK2.1亞家族蛋白同源度最高,因此我們將其命名為TaSnRK2.1。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),在小麥-葉銹菌不親和組合(TcLr26×260)及親和組合(Tc×260)中TaSnRK2.1在轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào),且在親和組合中的轉(zhuǎn)錄水平高于不親和組合,因此我們將其定為興趣基因。利用基因克隆技術(shù)獲得TaSnRK2.1編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,隨后分別對(duì)其功能和機(jī)制兩個(gè)方面進(jìn)行研究,在功能方面,我們首先分析TaSnRK2.1在不同親和組合中的表達(dá)變化,隨后進(jìn)一步使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)研究TaSnRK2.1對(duì)小麥抵抗葉銹病的影響。我們也通過GFP融合表達(dá)技術(shù)分析TaSnRK2.1的亞細(xì)胞定位。在機(jī)制方面,我們首先使用蛋白質(zhì)互作技術(shù)研究TaSnRK2.1與TaTCTP的互作狀態(tài),進(jìn)一步通過體外磷酸化試驗(yàn)分析TaTCTP是否可作為TaSnRK2.1的磷酸化底物。本試驗(yàn)獲得的主要結(jié)果如下:1.通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TaSnRK2.1在Tc和TcLr26接種葉銹菌生理小種260后的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化,結(jié)果顯示TaSnRK2.1在接種葉銹菌后均有上調(diào)表達(dá),且在Tc中相對(duì)表達(dá)量高于TcLr26,初步證明TaSnRK2.1基因參與小麥抵抗葉銹菌的過程。2.通過GFP熒光蛋白融合表達(dá)技術(shù)分析TaSnRK2.1在煙草表皮細(xì)胞中的分布狀態(tài),結(jié)果表明,TaSnRK2.1不僅存在于細(xì)胞質(zhì),而且在細(xì)胞核中也有分布。3.使用VIGS技術(shù)沉默TaSnRK2.1,結(jié)果顯示,在親和組合(Tc×260)中沉默TaSnRK2.1后,菌絲團(tuán)面積相較于對(duì)照減小,表明葉銹菌的發(fā)育受阻,增強(qiáng)了植株抗性。在不親和組合(TcLr26×260)中沉默TaSnRK2.1后,HR面積及吸器母細(xì)胞(Haustorial mother cell,HMC)數(shù)目相較于對(duì)照減少,也證明植株抗性增強(qiáng)。4.通過酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)初步分析TaSnRK2.1與TaTCTP能夠發(fā)生物理互作。隨后進(jìn)一步通過雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn)證明TaSnRK2.1能夠與TaTCTP在植物生理?xiàng)l件下發(fā)生互作。雙分子熒光互補(bǔ)結(jié)果顯示,TaSnRK2.1與TaTCTP的互作同時(shí)存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),與TaSnRK2.1的亞細(xì)胞定位一致。5.體外磷酸化試驗(yàn)證明,TaSnRK2.1具有明顯的激酶活性,然而TaSnRK2.1不能磷酸化TaTCTP,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TaTCTP抑制TaSnRK2.1的激酶活性。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.121.43
【圖文】：

TaSnRK2.1片段擴(kuò)增Figure1TaSnRK2.1fragmentamplification

圖 2 TaSnRK2.1 分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析注：紅色方框內(nèi)即為 TaSnRK2.1Figure 2 TaSnRK2.1 phylogenetic tree analysisNote: TaSnRK2.1 is in the red box.小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的表達(dá)分析.1 在葉銹菌侵染小麥過程的表達(dá)變化，采用 qRT-PCR 分析表達(dá)量。在TaSnRK2.1非保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物RT-SnRKTc 和 TcLr26 分別與葉銹菌生理小種 260 組成親和及不親d 左右）接種葉銹菌生理小種 260，并在接種后 0h、4h、 h、120 h 取樣。以接種后 0 h 作為對(duì)照，利用 qRT-PCR 檢，TaSnRK2.1 的相對(duì)表達(dá)量在親和組合（Tc×260）和不親和組 Tc 中相對(duì)表達(dá)量高于 TcLr26（‘*’代表 p≤0.05，‘**’果一致，初步推測(cè) TaSnRK2.1 基因在小麥抵抗葉銹菌侵染

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728992