【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)葉銹病由專化性非常強的活體寄生真菌葉銹菌(Puccinia triticina)侵染引起,其爆發(fā)年代導致小麥大量減產(chǎn),嚴重威脅糧食安全。本實驗室長期從事小麥抵抗葉銹菌侵染的分子機制研究,在不親和組合中,小麥通過過敏性反應-程序性細胞死亡(hypersensitive reaction-PCD,HR-PCD)來抑制葉銹菌的發(fā)育。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),小麥翻譯控制腫瘤蛋白(TaTCTP)能夠響應葉銹菌侵染,并參與HR-PCD的形成過程,對發(fā)生HR-PCD的細胞死亡進程具有正調(diào)控作用。為進一步研究TaTCTP在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的作用機制,本課題組前期借助TAP(串聯(lián)親和純化)與質(zhì)譜聯(lián)用,鑒定出一個Ser/Thr蛋白激酶,可能作為TaTCTP的潛在互作蛋白。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該蛋白激酶屬于蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)家族,與SnRK2.1亞家族蛋白同源度最高,因此我們將其命名為TaSnRK2.1。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),在小麥-葉銹菌不親和組合(TcLr26×260)及親和組合(Tc×260)中TaSnRK2.1在轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào),且在親和組合中的轉(zhuǎn)錄水平高于不親和組合,因此我們將其定為興趣基因。利用基因克隆技術(shù)獲得TaSnRK2.1編碼區(qū)全長序列,隨后分別對其功能和機制兩個方面進行研究,在功能方面,我們首先分析TaSnRK2.1在不同親和組合中的表達變化,隨后進一步使用病毒誘導的基因沉默技術(shù)研究TaSnRK2.1對小麥抵抗葉銹病的影響。我們也通過GFP融合表達技術(shù)分析TaSnRK2.1的亞細胞定位。在機制方面,我們首先使用蛋白質(zhì)互作技術(shù)研究TaSnRK2.1與TaTCTP的互作狀態(tài),進一步通過體外磷酸化試驗分析TaTCTP是否可作為TaSnRK2.1的磷酸化底物。本試驗獲得的主要結(jié)果如下:1.通過實時定量PCR檢測TaSnRK2.1在Tc和TcLr26接種葉銹菌生理小種260后的轉(zhuǎn)錄水平表達變化,結(jié)果顯示TaSnRK2.1在接種葉銹菌后均有上調(diào)表達,且在Tc中相對表達量高于TcLr26,初步證明TaSnRK2.1基因參與小麥抵抗葉銹菌的過程。2.通過GFP熒光蛋白融合表達技術(shù)分析TaSnRK2.1在煙草表皮細胞中的分布狀態(tài),結(jié)果表明,TaSnRK2.1不僅存在于細胞質(zhì),而且在細胞核中也有分布。3.使用VIGS技術(shù)沉默TaSnRK2.1,結(jié)果顯示,在親和組合(Tc×260)中沉默TaSnRK2.1后,菌絲團面積相較于對照減小,表明葉銹菌的發(fā)育受阻,增強了植株抗性。在不親和組合(TcLr26×260)中沉默TaSnRK2.1后,HR面積及吸器母細胞(Haustorial mother cell,HMC)數(shù)目相較于對照減少,也證明植株抗性增強。4.通過酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)初步分析TaSnRK2.1與TaTCTP能夠發(fā)生物理互作。隨后進一步通過雙分子熒光互補(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)試驗證明TaSnRK2.1能夠與TaTCTP在植物生理條件下發(fā)生互作。雙分子熒光互補結(jié)果顯示,TaSnRK2.1與TaTCTP的互作同時存在于細胞核和細胞質(zhì),與TaSnRK2.1的亞細胞定位一致。5.體外磷酸化試驗證明,TaSnRK2.1具有明顯的激酶活性,然而TaSnRK2.1不能磷酸化TaTCTP,進一步研究發(fā)現(xiàn)TaTCTP抑制TaSnRK2.1的激酶活性。
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.121.43
【圖文】：

TaSnRK2.1片段擴增Figure1TaSnRK2.1fragmentamplification

圖 2 TaSnRK2.1 分子系統(tǒng)進化樹分析注：紅色方框內(nèi)即為 TaSnRK2.1Figure 2 TaSnRK2.1 phylogenetic tree analysisNote: TaSnRK2.1 is in the red box.小麥抵抗葉銹菌侵染過程中的表達分析.1 在葉銹菌侵染小麥過程的表達變化，采用 qRT-PCR 分析表達量。在TaSnRK2.1非保守區(qū)設計特異性引物RT-SnRKTc 和 TcLr26 分別與葉銹菌生理小種 260 組成親和及不親d 左右）接種葉銹菌生理小種 260，并在接種后 0h、4h、 h、120 h 取樣。以接種后 0 h 作為對照，利用 qRT-PCR 檢，TaSnRK2.1 的相對表達量在親和組合（Tc×260）和不親和組 Tc 中相對表達量高于 TcLr26（‘*’代表 p≤0.05，‘**’果一致，初步推測 TaSnRK2.1 基因在小麥抵抗葉銹菌侵染

【參考文獻】

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本文編號：2728992