【摘要】：松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是一種極度危險(xiǎn)的入侵生物,由它引起的松樹萎蔫病(pine wilt disease)是全球森林生態(tài)系統(tǒng)中最有危險(xiǎn)及毀滅性的病害之一。我國(guó)自1982年在南京紫金山首次發(fā)現(xiàn)松樹萎蔫病至今,已累計(jì)已損失數(shù)十億株松樹,造成的直接經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)服務(wù)價(jià)值損失達(dá)幾千億元。長(zhǎng)期以來(lái),針對(duì)松材線蟲的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥,而化學(xué)殺線劑的長(zhǎng)期過(guò)度使用會(huì)導(dǎo)致線蟲產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,藥劑分子作用靶標(biāo)的運(yùn)用成為有害生物防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。理想的藥劑分子作用靶標(biāo)是參與有機(jī)體重要功能的基因產(chǎn)物,通過(guò)基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)這類基因的表達(dá)量能顯著影響有害生物正常生理機(jī)制,從而達(dá)到有害生物防治的效果。本研究以林業(yè)重要入侵物種松材線蟲為研究對(duì)象,利用三種常用殺線劑,篩選出松材線蟲多效耐藥相關(guān)基因,利用生物學(xué)信息學(xué)及RNAi技術(shù)進(jìn)行Bx-mrps基因功能分析,系統(tǒng)研究了 MRP家族中Bx-mrp1、Bx-mrp2、Bx-mrp3和Bx-mrp4基因?qū)�蟲耐藥性相關(guān)功能的影響,對(duì)制定松材線蟲新防治策略具有非常重要的理論意義。具體結(jié)果如下:1.測(cè)定了三種殺蟲劑的殺蟲活力并進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)利用灰葡萄孢菌絲培養(yǎng)并擴(kuò)繁松材線蟲作為實(shí)驗(yàn)蟲株,對(duì)苦參堿、阿維菌素及甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽三種藥劑溶劑進(jìn)行篩選,進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):苦參堿藥劑用ddH20溶解,阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽用二甲基亞砜作為溶劑效果最好;24 h時(shí)苦參堿、阿維菌素及甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽三種藥劑的LC50分別為4.0、0.15和0.10 mg/mL。2.研究了松材線蟲多效耐藥相關(guān)蛋白(MRP)生物信息學(xué)信息。本實(shí)驗(yàn)克隆并鑒定松材線蟲MRP家族中Bx-mrp1、Bx-mrp2、Bx-mrp3和Bx-mrp4基因,利用生物信息學(xué)分別對(duì)四個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):四種蛋白質(zhì)均由C、H、N、O和S五種元素組成;蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明,各蛋白質(zhì)中,α-螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲分別約占各基因所編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)總數(shù)的50%、15%、5%和30%;蛋白質(zhì)親疏水性分析及跨膜區(qū)域分析顯示,四種蛋白質(zhì)均為含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水性跨膜蛋白質(zhì);信號(hào)肽分析表明,除Bx-MRP3外,其他三種Bx-MRPs蛋白均無(wú)信號(hào)肽存在;糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析表明這四個(gè)基因均含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn);進(jìn)化分析表明四種基因所編碼的蛋白質(zhì)均屬于多效耐藥蛋白家族;蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明Bx-MRPs均含有多個(gè)核苷酸結(jié)合域和跨膜結(jié)構(gòu)域。試驗(yàn)結(jié)果初步明確了四種基因及其所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及保守序列特性,為松材線蟲MRP家族的研究提供了靶標(biāo)基因,也為潛在藥物靶標(biāo)的篩選奠定了分子基礎(chǔ)。3.明確了松材線蟲Bx-mrps四個(gè)基因在松材線蟲耐藥脅迫及免疫防御方面的功能。通過(guò)體外合成松材線蟲MRP家族四個(gè)基因的dsRNA,采用浸泡法對(duì)松材線蟲進(jìn)行RNAi基因沉默試驗(yàn),對(duì)四個(gè)基因的功能進(jìn)行初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):目標(biāo)基因dsRNA溶液浸泡處理后松材線蟲響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降,基因沉默效率較好。顯微觀察發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因沉默后松材線蟲表型活力下降,出現(xiàn)蜷縮、打結(jié)、顏色變暗、活動(dòng)遲緩等現(xiàn)象。藥劑生測(cè)實(shí)驗(yàn)表明Bx-mrps-dsRNA處理的松材線蟲在三種藥劑脅迫后的存活率顯著降低。繁殖力測(cè)定結(jié)果表明,松材線蟲多效耐藥基因Bx-mrps被沉默后,松材線蟲對(duì)灰葡萄孢的取食能力均有所降低。綜上研究驗(yàn)證了 MRP家族四個(gè)基因在松材線蟲中功能,明確了 MRP家族對(duì)線蟲多效耐藥的影響。為新分子靶標(biāo)的篩選提供了依據(jù),也為松材線蟲的預(yù)防和治理提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S763.18
【圖文】：

圖１－１松材線蟲的生活史（Ｋｉｋｕｃｈｉ，２０１１）逡逑１．３松材線蟲的為害逡逑松樹萎蔫病是全球森林生態(tài)系統(tǒng)中十分具有危險(xiǎn)性和毀滅性的林木病害。松材線蟲逡逑早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)德克薩斯州的長(zhǎng)葉松（Ｐ／ＷＷ＆邋ｐａ／ｚ？７／如）上；１９０５年，日本出現(xiàn)大量枯逡逑松樹記錄；１９７２年，Ｍａｍｉｙａ等認(rèn)為導(dǎo)致日本松樹萎蔫病的病原是松材線蟲；１９８２逡逑，在南京紫金山的中山陵發(fā)現(xiàn)松材線蟲，隨后在江蘇、浙江、安徽和廣東等地區(qū)也發(fā)逡逑松材線蟲，且為害相當(dāng)嚴(yán)重；１９９８年，在葡萄牙也發(fā)現(xiàn)松材線蟲的蹤跡；２００９年，逡逑

；ｉｏ／ｏ／Ｙ／．ｉｗｅｒａ、－、逡逑臭豆堿、槐胺堿、苦參堿等，均具有殺線蟲活性［２２】。逡逑隨著人們對(duì)健康、環(huán)保的要求大于對(duì)經(jīng)濟(jì)效益的需求時(shí)，新型、高效、無(wú)公害、無(wú)逡逑污染的綠色生物源藥劑也就成為了社會(huì)和自然科學(xué)發(fā)展的必然，逐漸成為科研工作者的逡逑隹占。逡逑１．３線蟲異物代謝通路研究進(jìn)展逡逑異物代謝顧名思義是一種代謝途徑，是指藥物等大分子異物在生物體細(xì)胞內(nèi)通過(guò)多逡逑種蛋白質(zhì)和酶的代謝轉(zhuǎn)化而排出體外的過(guò)程。生物體體內(nèi)許多參與藥物代謝的蛋白質(zhì)和逡逑酶存在遺傳變異性、遺傳多肽性和不同的遺傳表型，導(dǎo)致這些酶的含量或活性在不同生逡逑物個(gè)體間表現(xiàn)出明顯差異，這些酶所介導(dǎo)的代謝途徑在不同個(gè)體中就會(huì)出現(xiàn)很明顯的差逡逑異。因此異物代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶日益受到人們的關(guān)注。異物代謝通常分為三個(gè)階逡逑段：修飾、共軛和排泄。三個(gè)階段的蛋白或酶協(xié)同作用使異物從細(xì)胞中排出，達(dá)到抗藥逡逑或解毒的功能在異物代謝過(guò)程中，Ｉ期代謝酶如細(xì)胞色素Ｐ４５０邋（ＣＹＰ）氧化親脂毒逡逑素，然后通過(guò)ＩＩ期代謝酶如ＵＧＴ、ＧＳＴ進(jìn)一步加工，催化添加官能團(tuán)促進(jìn)排泄。最逡逑后，修飾的毒素通過(guò)ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Ｐ－糖蛋白、ＭＲＰ蛋白從細(xì)胞中排出【３（）１。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2726102