【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的單鏈RNA分子,在植物生長(zhǎng)發(fā)育及各種抗逆響應(yīng)中均發(fā)揮著重要的作用。目前,對(duì)植物mi RNA的研究已越來(lái)越深入,但關(guān)于miRNA對(duì)真菌響應(yīng)機(jī)制的報(bào)道還不夠廣泛,尤其是草莓mi RNA。本研究以八倍體‘艷麗’草莓為試材,將灰霉病菌誘導(dǎo)后的紅熟期草莓果實(shí)進(jìn)行小RNA組測(cè)序,從而鑒定出感染灰霉病菌的草莓果實(shí)中的miRNA和靶基因,篩選出差異表達(dá)的miRNA,并對(duì)靶基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析,以探究草莓miRNA對(duì)灰霉病菌的響應(yīng)。主要結(jié)果如下;1.分別采用灰霉病菌處理后48 h(T1)、72 h(T2)、96 h(T3)和120 h(T4)的草莓紅熟期果實(shí),以及無(wú)菌水處理的草莓紅熟期果實(shí)(CK1)和灰霉病菌(CK2)為試材,構(gòu)建了六個(gè)小RNA文庫(kù),發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的小RNA長(zhǎng)度以21 nt為首。在六個(gè)文庫(kù)中檢測(cè)到隸屬于58個(gè)miRNA家族的141個(gè)保守miRNA,以及35個(gè)新的miRNA。并對(duì)這176個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),分別在保守miRNA和新miRNA中預(yù)測(cè)到506和287個(gè)靶基因,這些靶基因的種類主要是SPL,NAC,HL-Zip,TMV,LRR,F-box/kelch,MYB和一些抗病相關(guān)的基因。2.利用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)灰霉病菌誘導(dǎo)的草莓果實(shí)miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析,結(jié)果顯示:與CK1相比,大部分保守miRNA和新miRNA在感病初期(T1、T2)是上調(diào)表達(dá)的,感病后期(T3、T4)又呈下調(diào)表達(dá)。選取其中6個(gè)差異表達(dá)miRNA(miR166a,miR167,miR5290a,fan-18,fan-20,fan-24),利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證分析,結(jié)果表明兩種表達(dá)量分析方法檢測(cè)到的結(jié)果基本一致。3.以‘艷麗’草莓果實(shí)為試材,采用RT-PCR技術(shù)成功克隆了草莓mi R5290a的靶基因PIRL,該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1554 bp,編碼517個(gè)氨基酸。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析了PIRL基因在灰霉病菌不同處理時(shí)間中的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量下調(diào),并在T2和T3時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)與miR5290a相反,推測(cè)mi R5290a負(fù)調(diào)控靶基因PIRL的表達(dá)。4.以植物pRI101-AN為載體,通過(guò)添加內(nèi)含子序列,以及兩段反向互補(bǔ)的PIRL特異片段,利用Xbal I/Smal I和Kpn I/EcoR I限制性核酸內(nèi)切酶,獲得含PIRL特異片段的干擾載體。運(yùn)用快速PCR定點(diǎn)突變技術(shù),獲得了mi R5290a的靶向位點(diǎn)消除,但翻譯的氨基酸序列不變的mPIRL序列,在此基礎(chǔ)上以植物pRI101-AN為載體,利用Nde I/Kpn I限制性核酸內(nèi)切酶,獲得含mPIRL編碼區(qū)序列的過(guò)表達(dá)載體。5.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得了過(guò)表達(dá)mPIRL基因的3個(gè)轉(zhuǎn)基因‘Ruegen’草莓株系。對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè),結(jié)果表明3個(gè)草莓株系中mPIRL的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照,由此可推斷3株均為轉(zhuǎn)基因植株。6.將獲得的含mPIRL過(guò)表達(dá)載體和PIRL干擾載體的菌液注射進(jìn)‘艷麗’草莓的白果中,并在白果轉(zhuǎn)紅期用灰霉病菌菌液進(jìn)行處理,觀察表型發(fā)現(xiàn):與無(wú)菌水處理的CK相比,mPIRL過(guò)表達(dá)的果實(shí)表型感病較輕,而PIRL干擾的果實(shí)表型感病較重。由此推測(cè),PIRL參與草莓抗灰霉病的響應(yīng)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.68
【圖文】：

圖 1 文庫(kù)構(gòu)建流程圖Fig. 1 Flow chart of Library Construction息學(xué)分析得的原始序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和控制，將質(zhì)量值低的、5’接頭

圖 2 六個(gè)文庫(kù)中的小 RNA 長(zhǎng)度大小分布Fig. 2 Size distribution of small RNAs in six libraries.這些 miRNA 家族中，miR1511（32 個(gè)），miR7782（23 個(gè)）和 miR159（大的家族，均含有 17 個(gè)以上的家族成員。另外，miR156（7 個(gè)），miR166（96（3 個(gè)），miR5290（3 個(gè)），miR319（2 個(gè)）以及 miR5289（2 個(gè)）也是含

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2724204