【摘要】：小熱休克蛋白家族(small heat shock protein,sHSP)是一類分子伴侶蛋白,不僅能夠保護(hù)機(jī)體免受脅迫損害,還在蛋白質(zhì)的折疊、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、降解過程以及信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。在之前的研究中我們克隆了一個(gè)水稻sHSP基因(OsHSP20),其編碼的蛋白不僅與水稻條紋病毒(Rice Stripe Virus,RSV)RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)互作,還能通過自身互作形成同源寡聚體,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成顆粒狀結(jié)構(gòu),但其具體功能尚不清楚。為了進(jìn)一步探索該基因的功能,本研究首先利用qRT-PCR技術(shù)檢測了OsHSP20在不同非生物脅迫下的表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)受高溫和鹽脅迫誘導(dǎo),但不受干旱處理的影響。隨后我們通過異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)OsHSP20的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)大腸桿菌和酵母細(xì)胞對高溫和鹽脅迫的耐受性;應(yīng)用原核表達(dá)純化的重組OsHSP20蛋白進(jìn)行生化活性分析表明該蛋白在體外具有分子伴侶活性。為了確定OsHSP20自身互作、分子伴侶活性及其介導(dǎo)的抗逆性三者之間存在的關(guān)系,我們又構(gòu)建了5個(gè)缺失突變體用于進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示OsHSP20自身互作、分子伴侶活性和抗逆特性均與其N-端和α-晶狀體結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain,ACD)結(jié)構(gòu)域密切相關(guān),表明該蛋白可能通過自身互作發(fā)揮其生理生化功能。為了進(jìn)一步探究此類sHSP在植物體內(nèi)的功能特性,我們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsHSP20和其同源物NbHSP20(本氏煙sHSP基因)分別導(dǎo)入水稻(Oryza sativa)和本氏煙(Nicotiana benthamiana)中。在對轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行脅迫處理后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)OsHSP20有效地減輕了高溫脅迫對水稻種子活性的損傷,促進(jìn)了種子萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育;同時(shí)也減輕了鹽脅迫對根生長的抑制,表明OsHSP20增強(qiáng)了水稻對高溫脅迫和鹽脅迫的耐受性。另一方面,人工接種番茄花葉病毒(Tomato Mosaic Virus,ToMV)、蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)和RSV至轉(zhuǎn)基因本氏煙植株,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NbHSP20的植株均延遲發(fā)病,表明NbHSP20可能正向調(diào)控本氏煙的抗病防衛(wèi)反應(yīng)。本研究結(jié)果將有助于闡明sHSP在植物抗逆反應(yīng)中的作用,同時(shí)為深入研究sHSP在植物病毒侵染過程中的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S432.41
【圖文】：

圖 1.2 sHSP 的三維結(jié)構(gòu)Fig.1.2 Typical structure of sHSPA：單倍體 B：二聚體 C：十二聚體A: Monomer B: Dimer C: 12 mer

OsHSP20 的表達(dá)量卻沒有發(fā)生顯著變化（圖2.1 C）。圖 2.1 非生物脅迫下 OsHSP20 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性分析Fig 2.1 Analysis of transcriptional expression characteristics of OsHSP20 under abiotic stress（A）45 ℃高溫脅迫；（B）50 mM NaCl 鹽脅迫；（C）5％PEG 干旱脅迫；數(shù)據(jù)是來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。頂部列的星號表示與 0 h 處的值的顯著差異（ns，不顯著; * P <0.05;** P <0.01）。(A) temperature of 45 ℃ (heat stress), (B) 50 mM NaCl (salinity stress), (C) 5% PEG (droughtstress). Data are mean ± SD from three independent experiments. The asterisks on the top of thecolumns indicate significant differences from the value at 0 h (ns, not significant; *P < 0.05; **P <0.01).為了進(jìn)一步分析 OsHSP20 在蛋白表達(dá)水平是否同樣受到高溫和鹽脅迫誘導(dǎo)，我們對兩種處理在不同時(shí)間段的水稻樣品進(jìn)行了 Western blot 檢測。結(jié)果如圖 2.2 A，在高溫脅迫后，OsHSP20 蛋白的表達(dá)量顯著增加，并且在 4 h 時(shí)表達(dá)

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本文編號：2718945