【摘要】：靈敏的嗅覺系統(tǒng)在昆蟲寄主定位、尋找配偶等行為過程中起著重要的作用。目前的研究表明,氣味結(jié)合蛋白(OBPs)、化學(xué)感受蛋白(CSPs)等多種蛋白在對氣味分子的識別過程中起著重要的功能,但對于OBPs或CSPs在昆蟲中確切的生理功能及識別氣味分子的機制并不是很清晰。前期在對林業(yè)重要害蟲松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敵松褐天牛腫腿蜂Sclerodermus sp.觸角轉(zhuǎn)錄組測序中,鑒定了多個OBPs和CSPs基因,但對于OBPs和CSPs在其嗅覺感受中功能并未深入了解。為此,本課題以松褐天牛腫腿蜂為研究對象,分析了SspCSP2的時空表達特征及與氣味分子的結(jié)合特性,探索了SspOBP7與寄主揮發(fā)物的結(jié)合特性及結(jié)合機制,以期為探明OBPs和CSPs在其嗅覺感受中的功能奠定理論基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:(一)松褐天牛腫腿蜂SspCSP2的功能分析1.松褐天牛腫腿蜂SspCSP2基因的克隆及時空表達特性通過PCR技術(shù),克隆得到了1個CSPs(SspCSP2,GenBank登錄號:ALG36155.1)的全長,其開放閱讀框為360bp,編碼120個氨基酸。qRT-PCR實驗技術(shù)分析了SspCSP2在松褐天牛腫腿蜂不同蟲態(tài)、不同組織的表達情況,結(jié)果表明,SspCSP2顯著表達于幼蟲、有翅雌蟲的腹部及無翅雌蟲的腹部,其中在有翅雌蟲腹部的表達量最高。2.重組SspCSP2與氣味物質(zhì)的結(jié)合特性成功構(gòu)建重組質(zhì)粒SspCSP2-pET20b,并大量表達于大腸桿菌BL21(DE3)中,利用DE52陰離子交換柱成功獲得純凈重組SspCSP2。以1-NPN為探針,利用熒光競爭性結(jié)合試驗,分析SspCSP2在pH 7.4和pH 5.0條件下與24種氣味分子的結(jié)合特性。結(jié)果表明,在酸性條件下,SspCSP2與大多數(shù)氣味物質(zhì)的結(jié)合能力高于中性條件,22種物質(zhì)展現(xiàn)出與SspCSP2具有較強的結(jié)合能力(Ki20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3種氣味物質(zhì)與SspCSP2的結(jié)合能力最強(Ki10μM);相反,SspCSP2與順-3-己烯醇和(+)-α-長葉蒎烯這2種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力則為在中性條件下的高于酸性條件;但pH對SspCSP2與反式-2-己烯醇的結(jié)合能力無影響。3.松褐天牛腫腿蜂SspCSP2的熒光猝滅分析Stern-Volmer方程分析SspCSP2與4種具有電生理活性物質(zhì)(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-異松油烯與(+)-α-長葉蒎烯)的猝滅類型,結(jié)果顯示4種物質(zhì)均為靜態(tài)猝滅;結(jié)合位點分析發(fā)現(xiàn),4種物質(zhì)與SspCSP2的結(jié)合比例均為1:1。熱力學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),4種物質(zhì)與SspCSP2之間的相互作用力均為疏水性作用力。(二)松褐天牛腫腿蜂SspOBP7與氣味分子的結(jié)合機制1.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的熒光猝滅分析SspOBP7與24種氣味分子的猝滅類型和相互作用研究結(jié)果表明,SspOBP7與18種氣味分子的猝滅類型屬于動態(tài)猝滅,余下的6種物質(zhì)屬于靜態(tài)猝滅;6種靜態(tài)猝滅的物質(zhì)中有3種物質(zhì)屬于非極性分子,分別為s-(-)檸檬烯、(+)-α-長葉蒎烯和異松油烯,與SspOBP7形成疏水性作用力;余下3種物質(zhì),反式-2-己烯醇、順-2-戊烯-1-醇和癸醛則屬于極性分子,與SspOBP7形成氫鍵作用;雙對數(shù)方程分析結(jié)果顯示,6種物質(zhì)與SspOBP7的結(jié)合比例均為1:1。2.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的結(jié)構(gòu)分析利用圓二色譜法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配體配比條件下的二級結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明,pH值的變化會引起SspOBP7的α螺旋含量的變化,其中pH 7.4條件下SspOBP7的α螺旋數(shù)最多,其次是pH 3.0,最少的為pH 5.0;設(shè)定pH 7.4,SspOBP7的α螺旋數(shù)會隨著配體配比的增加而減少;當(dāng)SspOBP7與配體按1:1結(jié)合后,改變體系pH值,蛋白的α螺旋數(shù)變化規(guī)律與SspOBP7純蛋白的一致。以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)為建模模板,對SspOBP7進行同源建模。結(jié)果顯示,SspOBP7具有6個α螺旋,3個二硫鍵,屬于Classical OBP;分子對接結(jié)果顯示SspOBP7中央具有一個結(jié)合腔,呈球狀,結(jié)合腔的表面具有三處極性區(qū)域,分別為Thr86、Tyr105和Phe118。分析極性區(qū)域處形成的氫鍵作用,發(fā)現(xiàn)Thr86處與配體形成氫鍵作用時,需要Tyr105的參與,Phe118與配體形成氫鍵作用的位置為主鏈上的氧原子,Tyr105可以單獨與配體形成氫鍵作用,且形成的位置為側(cè)鏈羥基上的氧原子。3.松褐天牛腫腿蜂SspOBP7的定點突變及與氣味分子結(jié)合機制針對Tyr105設(shè)計定點突變,突變成Phe105,目的是破壞氫鍵作用。表達、純化出重組突變蛋白,測定了突變蛋白與6種靜態(tài)猝滅物質(zhì)的結(jié)合情況。結(jié)果顯示,這6種物質(zhì)與突變蛋白的結(jié)合能力均有一定程度的減弱,但結(jié)合比例沒有改變。突變后的SspOBP7與極性分子葵醛的結(jié)合能力顯著下降,熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示,突變之后氫鍵作用消失;而突變后的SspOBP7與其它2種極性分子,反式-2-己烯醇和順-2-戊烯-1-醇,仍具有較強的結(jié)合能力,熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示,蛋白突變之后,氫鍵作用還存在,只是位置發(fā)生改變;突變后的SspOBP7與3個非極性分子結(jié)合能力明顯減弱,熒光猝滅和分子對接結(jié)果顯示,突變后仍為疏水性作用,但3個分子在結(jié)合腔內(nèi)的取向均發(fā)生了改變。通過對比分析蛋白的結(jié)合腔,發(fā)現(xiàn)SspOBP7突變之后,結(jié)合腔的體積明顯變大。綜上,松褐天牛腫腿蜂SspCSP2基因主要分布在蟲體腹部,SspCSP2對氣味物質(zhì)的選擇性差,SspCSP2與電生理活性物質(zhì)主要是通過疏水性作用力結(jié)合;SspOBP7與24種物質(zhì)中的3種極性分子和3種非極性分子結(jié)合,結(jié)合力分別為氫鍵作用和疏水性作用力,環(huán)境中改變pH值和配體的濃度均會使蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,極性區(qū)域的破壞會導(dǎo)致SspOBP7的結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變,從而影響蛋白與氣味分子的結(jié)合,相比之下,非極性分子結(jié)合力的改變更明顯,疏水性作用力所受影響比氫鍵作用力更明顯。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S763.38
【圖文】：

2-1 松褐天牛腫腿蜂 SspCSP2 基因的 RT-PCR-PCRAmplification of SspCSP2 Gene form Scl的表達模式分析CR 技術(shù)，分析了 SspCSP2 在松褐天牛腫腿，采用 2-△△Ct進行計算得知相對表達量，1-△Ct樣品2，所選的參照均為有翅觸角 D單因素方差分析，分析結(jié)果圖 2-2。通 DB、無翅雌蟲腹部 LB 及幼蟲 LA 中的表達，但量不是很大。

圖 2-2 松褐天牛腫腿蜂 SspCSP2 基因在不同時期和組織中的表達量. 2-2 Expression profiles of SspCSP2 in different development stages and differenfemale adults：幼蟲；PU：蛹；LA：無翅雌蟲的觸角；LL：無翅雌蟲的足；LB：無翅雌蟲的腹部；DA：有翅雌蟲的觸角蟲的足；DB：有翅雌蟲的腹部LV：Larva；PU：Pupa；LA：The antennae of a wingless female；LL：The foot of a wingless female；LB：Tess female；DA：The antennae of a winged female；DL：The foot of a winged female；DB：The abdomen of a3 討論利用基因克隆技術(shù)成功獲得了SspCSP2的基因全長，其大小為360bp。布范圍特別廣，且不同的分布部位、不同的分布時期可能會有不同功熒光定量 PCR 分析 SspCSP2 的分布部位，結(jié)果顯示，SspCSP2 基因在

【參考文獻】

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本文編號：2717413