【摘要】：大豆疫霉屬于卵菌的一種,它所引起的大豆疫病可造成豆科植株等不同程度的腐爛。目前,對大豆疫病的防治主要是采用甲霜靈等化學(xué)藥劑,但甲霜靈作用位點單一,容易產(chǎn)生抗藥性,因此,亟待開發(fā)新的抗卵菌藥物。微生物天然產(chǎn)物Borrelidin(BN)是以蘇氨酰tRNA合成酶(ThrRS)為靶標(biāo)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物,具有抗菌、抗瘧原蟲和抗癌等活性,但也對人體細(xì)胞具有很強的毒性,表明BN的分子結(jié)構(gòu)還存在缺陷,有待于進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造。本實驗室前期研究顯示,BN對包括大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)在內(nèi)的卵菌具有獨特的高抑制活性,其作用靶標(biāo)為大豆疫霉ThrRS(PsThrRS),但具體作用機制并不明晰。為了明確BN與PsThrRS的相互作用機理,為基于ThrRS為靶標(biāo)的藥物設(shè)計和BN的結(jié)構(gòu)改造提供參考信息,本研究采用同源建模的方法以人的ThrRS晶體結(jié)構(gòu)為模板獲得了野生型PsThrRS與突變體(截掉編輯區(qū)后的截短PsThrRS)三維結(jié)構(gòu)模型,然后分別與BN進行分子對接和動力學(xué)模擬鑒定PsThrRS活性中心的氨基酸殘基組成,并對野生型和突變型的截短PsThrRS與BN對接的結(jié)合自由能進行比較,同時通過點突變明確與BN相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基組成,并以此為基礎(chǔ)對化合物數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選,為獲得潛在抗卵菌藥物提供理論依據(jù)。本實驗主要研究結(jié)果如下:(1)首先從NCBI數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫中獲得PsThrRS的氨基酸序列(GenBank:JF727824.1)和人的截短ThrRS晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:4HWT,4P3N,4TTV),結(jié)合生物信息學(xué)中同源建模等分子模擬技術(shù)構(gòu)建了截短PsThrRS的三維結(jié)構(gòu)模型;采用分子對接和動力學(xué)模擬手段總結(jié)得出野生型PsThrRS活性中心構(gòu)成BN結(jié)合口袋的18個關(guān)鍵氨基酸殘基:Ser-410、Gly-411、His-412、His-415、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Phe-565、Tyr-566、Thr-586、Gln-588、Asp-590、Gln-592、Leu-593、His-616、Ala-618,其中15個氨基酸殘基在原核生物和真核生物中具有保守性,它們分別是:Gly-411、His-412、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Phe-565、Tyr-566、Thr-586、Gln-588、Asp-590、Leu-593、His-616、Ala-618。此外,動力學(xué)模擬結(jié)果顯示,在PsThrRS中還存在著另外的6個氨基酸與BN存在相互作用,分別為:Pro-438、Arg-478、Phe-482、His-488、Ala-564和Gly-621。分子對接結(jié)果顯示,在相互作用過程中Arg-466與BN-C30的O31,O32形成雙氫鍵,Gln-484與BN-C30上的O32形成單氫鍵,Tyr-566與BN-C25羥基形成單氫鍵,Tyr-566與BN-C13形成σ鍵和π鍵組成的共價雙鍵,Asp-590與BN-C13上的羥基形成單氫鍵,從而使BN穩(wěn)定地固定在結(jié)合口袋中,展現(xiàn)了BN與PsThrRS的深度契合性。通過虛擬突變技術(shù)構(gòu)建的突變型PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A、PsThrRS-Y566A和PsThrRS-G621A分別與BN對接后,其結(jié)合能降低了0.1-1.35 kcal/mol,表明氨基酸殘基Arg-466、Arg-478、Tyr-566和Gly-621對BN與截短PsThrRS的結(jié)合和對底物的催化可能起關(guān)鍵作用。(2)利用點突變技術(shù)和重疊PCR成功克隆了PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A和PsThrRS-Y566A三個突變型的表達載體,將實驗室已構(gòu)建的野生型PsThrRS和本研究構(gòu)建的突變型PsThrRS表達載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化,通過SDS-PAGE分析,重組菌株在16℃,IPTG終濃度為0.2 mmol/L時可獲得最優(yōu)表達量,并且重組蛋白主要以可溶性形式存在,包涵體形成較少;對誘導(dǎo)破碎后的上清液進行鎳柱梯度洗脫、超濾濃縮等純化處理,發(fā)現(xiàn)經(jīng)70 mM咪唑濃度洗脫液洗脫后,雜蛋白可被洗脫掉,經(jīng)100 mM咪唑濃度洗脫液洗脫后,目的蛋白可被洗脫下來,最終獲得純度達到了95%以上,濃度達到1 mg/mL的重組PsThrRS。(3)在對野生型PsThrRS基本酶動力學(xué)參數(shù)的測定后,結(jié)合米氏方程曲線,求得ATP的K_m=32.09μM,V_(max)=4.62μM/min,K_(cat)=6.32 min~(-1);Ser的K_m=0.09 mM,V_(max)=4.25μM/min,K_(cat)=5.82 min~(-1);tRNA的K_m=2.68μg/100μL,V_(max)=4.07μM/min,K_(cat)=5.58 min~(-1),PsThrRS對底物ATP的親和力大于Ser。同時完成了對PsThrRS突變體的酶活性測定并比較了它們與野生型PsThrRS之間酶活性的變化,結(jié)果表明突變型PsThrRS-R466A,PsThrRS-R478A和PsThrRS-Y566A的活性分別降低了20.22%、57.80%和58.84%,由此可以判斷氨基酸殘基R466,R478和Y566在氨�；磻�(yīng)過程中與底物的催化作用有關(guān),從實驗上驗證了分子模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性。(4)BN抑制野生型PsThrRS的IC_(50)為4.4 nM,抑制突變型PsThrRS-R466A、PsThrRS-R478A、PsThrRS-Y566A的IC_(50)分別為4.6μM、1.4μM和2.6μM,本研究體系中酶的濃度為0.73μM,相比于野生型PsThrRS表觀抑制常數(shù)(apparent inhibition constant)K_i~((app))值增加了300-1000倍,即Arg-466、Arg-478和Tyr-566的突變可導(dǎo)致PsThrRS對BN產(chǎn)生很明顯的抗性,這也同樣驗證了虛擬點突變結(jié)果的可信性。(5)在CHEMBL的數(shù)據(jù)庫中搜索出37個與BN結(jié)構(gòu)相似性大于70%的小分子化合物,利用分子對接軟件AutoDock vina進行虛擬篩選得到30個結(jié)合自由能低于BN且與PsThrRS具有親和力的先導(dǎo)化合物。最終選擇了3種對接效果最好而且具有潛在的防治大豆疫霉病的化合物:CHEMBL2349167、CHEMBL2349177和CHEMBL2349166,與BN相比,這三個化合物在五元環(huán)C2羧基上的O31分別換成了酪胺酰、芐基和丙氨酰,表明在PsThrRS上與BN五元環(huán)C2上的羧基形成雙氫鍵的Arg-466為關(guān)鍵氨基酸。以上研究為新抗真菌藥物的開發(fā)提供了新的參考和理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.651
【圖文】：

其作用機制orrelidin（BN）最初是從海洋拮抗放線菌發(fā)酵液中分離出來的，在生物學(xué)功能上表現(xiàn)細(xì)菌、真菌，抗瘧原蟲，殺蟲和除草，而且研制血管生成[39-43]。BN 能救治受致命瘧原蟲侵的 FCR3 菌株和 drugresistant K1 菌株（IC50的抗瘧藥，包括蒿甲醚，青蒿琥酯和氯喹更為成（IC50：0.8 nM）[46]。在相同劑量下抑制血性肺轉(zhuǎn)移[47]。這些不同的抑制活性都是作用于性抑制蘇氨酰 tRNA 合成酶（ThrRS）展現(xiàn)如何同時抑制細(xì)菌生長和各種動植物的感染 BN 的單分子分別同時占據(jù)著細(xì)菌和人 ThrR位點上與氨基�；嚓P(guān)的的三個底物氨基酸，外“直角”位點（如圖 1-1），并通過酶的高]。

1.2.1.2 Borrelidin 的作用機理通過詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和功能分析，在研究人類和大腸桿菌 ThrRS 與 BN 結(jié)合后的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，確定了一個獨特的 BN 抑制 ThrRS 的結(jié)構(gòu)抑制機制：BN 占據(jù)著 ThrRS 的結(jié)合口袋，對三個底物具有排阻作用（如圖 1-2），即 Thr，ATP，tRNA。

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