【摘要】：葡萄是世界性果樹,其果實(shí)用于鮮食、釀酒、制汁以及制干,具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葡萄中的白藜蘆醇作為葡萄中重要的植保素,不僅可以促進(jìn)植物抗各種生物與非生物脅迫,而且在人體中可以發(fā)揮抗癌、抗氧化、保護(hù)心血管等功能。中國野生毛葡萄丹鳳-2(Vitis quinquangularis accession Danfeng-2)抗病性強(qiáng),白藜蘆醇含量高。本研究以中國野生毛葡萄丹鳳-2為材料,篩選調(diào)控芪合成酶(Stilbene synthase,STS)基因表達(dá)的WRKY及bZIP轉(zhuǎn)錄因子。分析轉(zhuǎn)錄因子的基因結(jié)構(gòu),表達(dá)模式及對(duì)STS基因的調(diào)控方式。揭示中國野生毛葡萄丹鳳-2攜帶的轉(zhuǎn)錄因子基因具有調(diào)控STS基因表達(dá)與促進(jìn)植物抗病的作用,為今后利用這個(gè)特異野生葡萄資源進(jìn)行抗病育種提供理論依據(jù)。取得主要結(jié)果如下:1、利用qRT-PCR研究了中國野生毛葡萄丹鳳-2在接種白粉菌條件下,59個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員的表達(dá)差異。其中有19個(gè)WRKY成員包括VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY6,VqWRKY7,VqWRKY10,VqWRKY18,VqWRKY21,VqWRKY23,VqWRKY26,VqWRKY27,VqWRKY28,VqWRKY29,VqWRKY30,VqWRKY31,VqWRKY32,VqWRKY48,VqWRKY49,VqWRKY52,VqWRKY53在白粉菌誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)。利用同源克隆的方法,在丹鳳-2中克隆得到VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53的編碼序列,分別為1779bp,570bp,780bp,582bp和456bp。NCBI登錄號(hào)分別為:VqWRKY2(MN240478),VqWRKY3(MN240479),VqWRKY9(MN240480),VqWRKY24(MN240481),VqWRKY53(MN240482)。VqWRKY2屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的groupⅡb亞家族,VqWRKY3,VqWRKY24和VqWRKY53屬于groupⅡc亞家族,VqWRKY9屬于groupⅡa亞家族。同時(shí),克隆得到VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行元件分析。通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果表明VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53均定位于細(xì)胞核內(nèi)。2、在接種葡萄白粉菌和外源處理flg22,H_2O_2,CaCl_2情況下,利用qRT-PCR分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及STS基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明,在白粉菌接種后VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY53和STS基因表達(dá)量升高,而VqWRKY9和VqWRKY24下調(diào)表達(dá)。在flg22處理下,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY53和STS基因受flg22誘導(dǎo)表達(dá)量顯著提高。在H_2O_2處理下,VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24,VqWRKY53和STS表達(dá)量都顯著提高。在CaCl_2處理下,僅有VqWRKY53與STS表達(dá)量上調(diào)。VqWRKY3,VqWRKY9以及VqWRKY53對(duì)flg22的響應(yīng)需要經(jīng)由活性氧爆發(fā)和MAPK級(jí)聯(lián)途徑。3、對(duì)中國野生毛葡萄丹鳳-2的葉片進(jìn)行外源激素SA,ABA,Eth和MeJA處理。利用qRT-PCR,分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及STS基因?qū)に匦盘?hào)的響應(yīng)模式。結(jié)果表明,VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY53以及STS在SA,ABA,Eth和MeJA的誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)。VqWRKY9在SA,ABA以及MeJA的誘導(dǎo)下表達(dá)量提高。VqWRKY24在SA的誘導(dǎo)下表達(dá)量上調(diào)。4、通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明VqWRKY3與VqMYB14蛋白互作,VqWRKY53和VqMYB14,VqMYB15兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別互作。以丹鳳-2的gDNA為模版,克隆得到VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48的啟動(dòng)子,序列分析表明這5條STS啟動(dòng)子序列均包含WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明,VqWRKY2可以結(jié)合VqSTS9,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48的啟動(dòng)子。VqWRKY3可以結(jié)合VqSTS16和VqSTS48的啟動(dòng)子。VqWRKY9和VqWRKY24可以結(jié)合VqSTS9,VqSTS16,VqSTS41和VqSTS48的啟動(dòng)子。VqWRKY53可以結(jié)合VqSTS9,VqSTS16和VqSTS41的啟動(dòng)子。5個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子均可以結(jié)合TTGACC元件,而只有VqWRKY9和VqWRKY53可以結(jié)合TTGACT元件。5、利用GUS活性定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)STS啟動(dòng)子的影響。結(jié)果表明,VqWRKY2、VqWRKY9分別可以上調(diào)VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48啟動(dòng)子活性。VqWRKY3可以上調(diào)VqSTS32和VqSTS48啟動(dòng)子活性。VqWRKY24可以上調(diào)VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48啟動(dòng)子活性。VqWRKY53可以上調(diào)VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41啟動(dòng)子活性。共表達(dá)VqWRKY3與VqMYB14可以上調(diào)VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32和VqSTS41啟動(dòng)子活性。但是相對(duì)于單獨(dú)轉(zhuǎn)化VqWRKY3,共表達(dá)VqWRKY3與VqMYB14降低了對(duì)VqSTS48的啟動(dòng)子活性。共表達(dá)VqWRKY53與VqMYB14或VqMYB15可以在不同程度上調(diào)STS啟動(dòng)子活性。在丹鳳-2的葉片中瞬時(shí)過量表達(dá)WRKY轉(zhuǎn)錄因子,STS基因的表達(dá)量提高。利用高效液相色譜對(duì)芪類物質(zhì)的含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)WRKY轉(zhuǎn)錄因子提高反式白藜蘆醇及反式云杉新苷的含量。異源過量表達(dá)VqWRKY2可以經(jīng)由JA途徑提高擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌的抗性。異源過量表達(dá)VqWRKY53可以引起AtSAG12表達(dá)量升高,活性氧積累,SA含量升高,促進(jìn)葉片衰老。過量表達(dá)VqWRKY5還可以經(jīng)由SA途徑增強(qiáng)擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌的抗性。6、利用同源克隆的方法,從丹鳳-2中克隆得到VqbZIP1。VqbZIP1的編碼序列全長為900bp,編碼299個(gè)氨基酸。GenBank登錄號(hào)為:AXN75965.1。qRT-PCR結(jié)果表明,VqbZIP1在葡萄的各個(gè)組織器官中均有表達(dá),其表達(dá)量在成熟果實(shí)中最高。VqbZIP1對(duì)ABA,Eth和MeJA的響應(yīng)較為顯著。VqbZIP1同樣響應(yīng)白粉菌誘導(dǎo)以及CaCl_2和H_2O_2小分子信號(hào)。亞細(xì)胞定位和酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證明,VqbZIP1定位于細(xì)胞核并且在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。通過酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明VqbZIP1與ABA信號(hào)通路上的核心元件VqSnRK2.4和VqSnRK2.6互作。序列分析表明VqSnRK2.4和VqSnRK2.6基因分別位于7號(hào)和3號(hào)染色體上,分別與擬南芥中的AtSnRK2.4和AtSnRK2.6同源性最高。亞細(xì)胞定位表明,VqSnRK2.4和VqSnRK2.6在細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核以及細(xì)胞膜上都有存在。在ABA激素誘導(dǎo)下,VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20,VqSnRK2.4和VqSnRK2.6都出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)。以丹鳳-2的gDNA為模版,克隆VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的啟動(dòng)子序列,對(duì)其進(jìn)行順式作用元件分析,3條啟動(dòng)子序列均含有響應(yīng)ABA信號(hào)的ABRE順式作用元件。將啟動(dòng)子構(gòu)建到pC0380-GUS載體,GUS活性定量實(shí)驗(yàn)表明,VqbZIP1可以激活VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的啟動(dòng)子活性。相對(duì)于單轉(zhuǎn)VqbZIP1,共表達(dá)VqbZIP1與互作基因VqSnRK2.4和VqSnRK2.6可以更大幅度的激活STS啟動(dòng)子活性。在丹鳳-2的葉片中過量表達(dá)VqbZIP1,通過qRT-PCR和HPLC實(shí)驗(yàn)證明過量表達(dá)VqbZIP1可以上調(diào)STS基因表達(dá)總量以及VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的表達(dá)量,引起白藜蘆醇與云杉新苷的含量增高。異源過量表達(dá)VqbZIP1可以增加擬南芥對(duì)ABA的敏感性,上調(diào)ABA信號(hào)通路的關(guān)鍵基因。綜上所述,中國野生毛葡萄轉(zhuǎn)錄因子VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53以及VqbZIP1參與正向調(diào)控芪合成酶基因的表達(dá),促進(jìn)植物的抗病性。
【圖文】：

杉醇 (Bavaresco et al. 2002)。在正常的條件下，芪類物質(zhì)在低水平，但是會(huì)在多種生物和非生物脅迫下在植物體內(nèi)大物質(zhì)可以響應(yīng)多種病原菌侵染包括：白粉病 (Fung et al. 20病 (Langcake & Pryce 1976)，灰霉病 (Adrian et al. 1997; Beavaresco et al. 2003; Vezzulli et al. 2007)。的合成經(jīng)由苯丙氨酸代謝途徑，芪合成酶（Stilbene syntha蘆醇合成的最后 步催化酶最早是從花生的懸浮細(xì)胞nd Kindl 1984)。在苯丙氨酸途徑中，首先苯丙氨酸經(jīng)由苯丙。肉桂酸進(jìn) 步被肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxy。緊接著香豆酸裂解酶（4-cumaroyl, 4CL）裂解香豆酸生成爾酮合成酶（Chalcone synthase ,CHS）和芪合成酶競爭底個(gè)分支。其中查爾酮合成酶催化合成黃酮類物質(zhì)，而芪合酶 A 和 分子的香豆酸輔酶 A 合成芪類物質(zhì)白藜蘆醇 (

第二章 中國野生毛葡萄 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控芪類物質(zhì)合成與抗病研究生毛葡萄丹鳳-2 的葉片進(jìn)行白粉菌接種，并在接種后的 0 、12 、24 、48、72、行 qRT-PCR 分析。此處選用 GAPDH 做為內(nèi)參基因，表達(dá)量的誤差（SD）取自-1 Expression analysis of WRKY transcription factors in Chinese wild Vitis quinquangresponse to powdery mildew infection.f Danfeng-2 were inoculated with powdery mildew and samples were collected at 0, d 120 h after inoculation for qRT-PCR. GAPDH was used here as an internal reference bar (SD) was calculated from three biological replicates.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.631

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2711398