【摘要】：百合無癥病毒(LSV)是危害百合科植物主要病毒,屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus),該病毒寄主范圍較窄,只侵染百合科植物,目前尚未有有效辦法進(jìn)行根治。LSV是單正鏈RNA病毒,全長8394bp,具有6個(gè)開放讀碼框,編碼4個(gè)蛋白分別為RbRp,TGB1-3,CP,16kDa。其中LSV-16kDa是功能未知蛋白,查閱文獻(xiàn)推測可能是基因沉默基因,與RNA沉默機(jī)制相關(guān)。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段,分析LSV-16kDa蛋白與RNA沉默過程中關(guān)鍵蛋白的互作關(guān)系,進(jìn)而闡明LSV-16kDa蛋白功能,為徹底根治LSV致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:通過與韓國,日本,中國浙江等地LSV-16kDa序列Blast比對分析,LSV-16kDa非常保守,具有Carla4家族核酸結(jié)合功能域,說明在基因組中是關(guān)鍵功能基因。磷酸化分析得知其存在磷酸化調(diào)控的可能性,糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)LSV-16kDa存在N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn);多重算法預(yù)測LSV-16kDa二級結(jié)構(gòu)N端為α-helix-coil-α-helix結(jié)構(gòu)。Swiss model網(wǎng)站同源建模,對建模結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估,所建同源模型蛋白質(zhì)空間分布合理。同源建模LSV-16kDa的N端結(jié)構(gòu)域,為無規(guī)則卷曲連接的2段α-螺旋,該結(jié)果與多重算法計(jì)算結(jié)果一致。N端結(jié)構(gòu)域的α-helix-loop-α-helix結(jié)構(gòu)中堿性氨基酸位于2段α-螺旋上,可通過氫鍵及靜電力與核酸結(jié)合,α-螺旋上的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)可通過絞連,進(jìn)一步與siRNA互作,推測LSV-16kDa具有沉默抑制子功能基礎(chǔ)。將關(guān)鍵位點(diǎn)堿性氨基酸進(jìn)行突變,命名為LSV-Δ16kDa。將LSV-Δ16kDa,LSV-16kDa同時(shí)添加純化標(biāo)簽,去除終止密碼子,轉(zhuǎn)入原核載體進(jìn)行表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件,獲得可溶的LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa蛋白。通過Western Blot特異性分析證明所表達(dá)的蛋白為目標(biāo)蛋白LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa,使用層析鎳柱將目標(biāo)蛋白純化。LSV-16kDa與綠色熒光蛋白融合構(gòu)建入真核雙源表達(dá)載體PBI121,轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101。激光共聚焦顯微鏡觀察LSV-16kDa定位于細(xì)胞核,此為沉默抑制子關(guān)鍵因素。生理檢測發(fā)現(xiàn)受感染的植株,POD,SOD,PAL活性均迅速上調(diào),以抵抗LSV-16kDa侵染;同時(shí)病程相關(guān)基因HSP90及PR1均上調(diào)表達(dá),其中HSP90隨侵染時(shí)間表達(dá)量上調(diào);而PR1隨侵染時(shí)間表達(dá)量下降。研究RNA沉默機(jī)制中關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn),AGO和DCL均出現(xiàn)上調(diào),AGO2比AGO1,AGO4響應(yīng)較快;DCL2比DCL1,DCL3響應(yīng)較快,推測AGO2,DCL2均為RNA沉默中與LSV-16kDa互作的關(guān)鍵通路。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S436.8

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐慶華,付暢,黃永芬;RNA干擾應(yīng)用新進(jìn)展[J];生物技術(shù);2005年01期

2 呂曉丹;香基嶠;石清清;陳蘭;張維維;劉坤;成慧娟;農(nóng)榮卯;詹靈凌;呂小平;李山;;小干擾RNA沉默尿激酶型纖溶酶原激活物受體和組織蛋白酶B基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移的影響及其機(jī)制[J];廣西醫(yī)學(xué);2018年10期

3 王鳳玲;;利用小干擾RNA沉默長非編碼RNA ZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對非小細(xì)胞肺癌的抗腫瘤活性[J];生物技術(shù)通訊;2018年04期

4 李文浩;賈鐘楠;李香;;小干擾RNA沉默人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞對組織蛋白酶S表達(dá)的影響[J];延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào);2019年02期

5 雍紅梅;周學(xué)義;趙薇;馮振卿;;RBM4a基因表達(dá)與功能研究進(jìn)展[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2018年07期

6 鐘苗;RNA沉默:基因組的免疫系統(tǒng)[J];免疫學(xué)雜志;2004年02期

7 金太成;楊麗萍;勾暢;許亞男;鄭爽;;植物中RNA沉默機(jī)制的研究進(jìn)展[J];吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年04期

8 田野;曹雪松;;植物基因沉默的研究進(jìn)展[J];聊城大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年01期

9 楊暉,趙鸝;植物中RNA介導(dǎo)的沉默及其應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年01期

10 劉文寶;張衛(wèi)華;劉春香;王志峰;曹齊衛(wèi);孫小鐳;;RNA沉默研究進(jìn)展[J];濰坊學(xué)院學(xué)報(bào);2007年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前3條

1 吳建國;;基于RNA沉默的水稻抗病毒和病毒致病[A];2018中國作物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2018年

2 張鑫;李源源;王穎;張宗英;張永亮;王獻(xiàn)兵;李大偉;于嘉林;韓成貴;;蕓薹黃化病毒P0蛋白類F-box基序突變體RNA沉默抑制活性和致壞死能力的驗(yàn)證[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2018年

3 蔣琳;錢丹;魏春紅;李毅;;水稻OsRDR6基因在病毒誘導(dǎo)的基因沉默中的功能研究[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 ATTA UR REHMAN;CYVCV蛋白間互作特點(diǎn)及其RNA沉默抑制子的鑒定研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 胡瓊;dsRNA介導(dǎo)的煙草和番茄抗病毒基因工程研究[D];浙江大學(xué);2010年

3 景秀麗;禽類病毒RNA沉默抑制子的篩選鑒定及功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 唐前君;雙生病毒外殼蛋白和傳毒相關(guān)蛋白基因介導(dǎo)的病毒抗性研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 孫兆楠;高沉默效率植物病毒雙鏈RNA的抗病毒研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 白描;番茄RNA沉默體系的鑒定及其抗病毒新方法的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

7 顏康;高溫脅迫誘導(dǎo)的可變剪切調(diào)控植物MicroRNA加工的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 姜芳;馬鈴薯Y病毒CP基因不同區(qū)段對發(fā)夾RNA和人工的miRNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張瑞U，

本文編號：2711020