【摘要】：百合無癥病毒(LSV)是危害百合科植物主要病毒,屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus),該病毒寄主范圍較窄,只侵染百合科植物,目前尚未有有效辦法進行根治。LSV是單正鏈RNA病毒,全長8394bp,具有6個開放讀碼框,編碼4個蛋白分別為RbRp,TGB1-3,CP,16kDa。其中LSV-16kDa是功能未知蛋白,查閱文獻推測可能是基因沉默基因,與RNA沉默機制相關(guān)。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,通過生物信息學和分子生物學等手段,分析LSV-16kDa蛋白與RNA沉默過程中關(guān)鍵蛋白的互作關(guān)系,進而闡明LSV-16kDa蛋白功能,為徹底根治LSV致病機理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:通過與韓國,日本,中國浙江等地LSV-16kDa序列Blast比對分析,LSV-16kDa非常保守,具有Carla4家族核酸結(jié)合功能域,說明在基因組中是關(guān)鍵功能基因。磷酸化分析得知其存在磷酸化調(diào)控的可能性,糖基化位點分析發(fā)現(xiàn)LSV-16kDa存在N-糖基化和O-糖基化位點;多重算法預測LSV-16kDa二級結(jié)構(gòu)N端為α-helix-coil-α-helix結(jié)構(gòu)。Swiss model網(wǎng)站同源建模,對建模結(jié)果進行質(zhì)量評估,所建同源模型蛋白質(zhì)空間分布合理。同源建模LSV-16kDa的N端結(jié)構(gòu)域,為無規(guī)則卷曲連接的2段α-螺旋,該結(jié)果與多重算法計算結(jié)果一致。N端結(jié)構(gòu)域的α-helix-loop-α-helix結(jié)構(gòu)中堿性氨基酸位于2段α-螺旋上,可通過氫鍵及靜電力與核酸結(jié)合,α-螺旋上的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)可通過絞連,進一步與siRNA互作,推測LSV-16kDa具有沉默抑制子功能基礎(chǔ)。將關(guān)鍵位點堿性氨基酸進行突變,命名為LSV-Δ16kDa。將LSV-Δ16kDa,LSV-16kDa同時添加純化標簽,去除終止密碼子,轉(zhuǎn)入原核載體進行表達并優(yōu)化表達條件,獲得可溶的LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa蛋白。通過Western Blot特異性分析證明所表達的蛋白為目標蛋白LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa,使用層析鎳柱將目標蛋白純化。LSV-16kDa與綠色熒光蛋白融合構(gòu)建入真核雙源表達載體PBI121,轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101。激光共聚焦顯微鏡觀察LSV-16kDa定位于細胞核,此為沉默抑制子關(guān)鍵因素。生理檢測發(fā)現(xiàn)受感染的植株,POD,SOD,PAL活性均迅速上調(diào),以抵抗LSV-16kDa侵染;同時病程相關(guān)基因HSP90及PR1均上調(diào)表達,其中HSP90隨侵染時間表達量上調(diào);而PR1隨侵染時間表達量下降。研究RNA沉默機制中關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn),AGO和DCL均出現(xiàn)上調(diào),AGO2比AGO1,AGO4響應(yīng)較快;DCL2比DCL1,DCL3響應(yīng)較快,推測AGO2,DCL2均為RNA沉默中與LSV-16kDa互作的關(guān)鍵通路。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S436.8

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本文編號：2711020