【摘要】：黃芪根腐病的發(fā)生是嚴(yán)重制約黃芪產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素之一,培育和利用抗病品種是防治黃芪根腐病最為經(jīng)濟(jì)、有效的手段。本論文以黃芪—根腐病優(yōu)勢(shì)致病菌為研究體系,對(duì)致病菌細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生和植物防御酶系統(tǒng)的激活進(jìn)行研究,并基于~1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析互作過程中代謝物譜的整體變化,以期為針對(duì)黃芪根腐病的抗病育種和發(fā)現(xiàn)新的互作機(jī)制提供依據(jù)與思路。(1)以根腐病優(yōu)勢(shì)致病菌Fusarium acuminatum、F.solani和F.oxysporum為研究對(duì)象,對(duì)其活體外誘導(dǎo)和黃芪回接致病后細(xì)胞壁降解酶(CWDEs)的動(dòng)態(tài)變化,采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明:在活體誘導(dǎo)條件下,3種根腐病菌均可產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、果膠甲基反式消除酶(PGTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PMTE)、羧甲基纖維素酶(Cx)和β-葡萄糖苷酶(βG)。其中,F.acuminatum產(chǎn)生PG、PMG、βG和PMTE的能力最強(qiáng);F.solani產(chǎn)生PGTE的能力明顯高于其他兩種病菌;Cx的產(chǎn)生能力F.acuminatum和F.oxysporum強(qiáng)于F.solani。致病回接試驗(yàn)中,選取活體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的主要酶PG、PMG、Cx和βG進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,F.solani產(chǎn)生PMG的能力較為突出;F.acuminatum產(chǎn)生PG和Cx的能力優(yōu)于其他兩種菌;F.oxysporum則具有較強(qiáng)分泌βG的能力。上述結(jié)果說(shuō)明,不同根腐病菌在活體外產(chǎn)生CWDEs的能力有所差異;侵染黃芪過程中各自分泌CWDEs的能力也不相同,說(shuō)明3種根腐病菌具有不同的致病機(jī)制。(2)將在山西省致病性強(qiáng)、分布廣、且分離頻率高的根腐病菌F.solani和F.acuminatum,采用幼苗浸根法接種黃芪,分光光度法測(cè)定其發(fā)病過程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化。結(jié)果表明,F.solani侵染黃芪后,PAL活性隨發(fā)病程度的加深逐漸降低,且明顯低于對(duì)照;PPO活性在侵染前期與對(duì)照組差異不明顯,在侵染后期卻顯著低于對(duì)照;POD酶活水平雖稍高于對(duì)照組,但其活性在不同時(shí)間段無(wú)顯著變化;SOD活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加,且明顯高于對(duì)照。上述結(jié)果說(shuō)明:F.solani侵染黃芪后不能激活PAL、PPO和POD的活性,但SOD的活性的明顯升高意味著活性氧清除系統(tǒng)能夠可能被激活。F.acuminatum侵染黃芪后,PAL、POD、PPO和SOD這4種防御酶的活性均隨發(fā)病程度的加深呈先升高后降低的趨勢(shì),且酶活水平明顯高于對(duì)照。其中,SOD活性在7 d時(shí)達(dá)到高峰,POD在14 d時(shí)達(dá)到酶活峰值,PAL和PPO酶活均在21 d時(shí)達(dá)到最大值。說(shuō)明F.acuminatum侵染激活了上述各防御酶的活性,但其活性高峰出現(xiàn)的時(shí)間并不相同。可見,由于致病機(jī)制的不同,這兩種病菌在侵染過程中引發(fā)的植物抗病機(jī)制也有差異。(3)以山西黃芪根腐病最重要的致病菌F.solani為研究對(duì)象,盆栽灌根法接種黃芪,以未接種的健康植株為對(duì)照,不同時(shí)間點(diǎn)采集樣品,采用~1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)黃芪發(fā)病過程中代謝物種類和含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行測(cè)定,通過PCA和OPLS-DA相結(jié)合的多元統(tǒng)計(jì)分析方法,尋找出13種差異代謝物。其中,氨基酸類差異代謝物為纈氨酸、精氨酸、蘇氨酸、氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和苯丙氨酸;有機(jī)酸類差異代謝物為檸檬酸、�；撬岷吞O果酸;糖類差異代謝物為果糖和蔗糖。對(duì)上述代謝物含量變化與根腐病發(fā)病情況進(jìn)行相關(guān)性分析,找出與根腐病發(fā)生最為相關(guān)的8種代謝物,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,確定黃芪抗病指示物可能為天冬氨酸、苯丙氨酸、蔗糖和果糖,感病指示物可能為谷氨酰胺。
【圖文】：

圖 1-1 實(shí)驗(yàn)流程圖1.2.2 本課題的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)本課題的創(chuàng)新之處為：(1)選題上，首次以山西黃芪根腐病菌(F. acuminatum、F. solani 和 F. oxysporum)和黃芪互作體系為對(duì)象，進(jìn)行互作機(jī)制研究。(2)思路上，以生理互作過程中的酶學(xué)響應(yīng)和代謝組學(xué)變化為切入點(diǎn)，闡釋根腐病菌與黃芪的互作機(jī)制。(3)方法上，首次利用基于1H NMR 的代謝組學(xué)技術(shù)，分析根腐病菌 F. solani 與黃芪互作過程中代謝物譜的整體變化，指認(rèn)相關(guān)的感病/抗病代謝產(chǎn)物。

3.2.6.2 紫外分光光度法測(cè)定 PGTE 和 PMTE 活力PGTE 和 PMTE 活性測(cè)定[55]：在 1.0 mL 酶液加入 1.0 mL 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.0)和 1 mL 底物(PGTE 的底物為多聚半乳糖醛酸，，PMTE 的底物為果膠)，再加入 1.0 mL 3 mmol/L CaCl2后，再在 30 ℃下水浴反應(yīng) 10 min，最后取 mL 在 OD232nm 處測(cè)定反應(yīng)前后的活性。3.2.7 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件中的 Duncan 氏新復(fù)極差法來(lái)分析各組間的差異顯著性。3.3 結(jié)果與分析3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3.1.1.1 葡萄糖和 D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖、D-半乳糖醛酸與 DNS 試劑反應(yīng)后，測(cè)定 OD540nm值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖標(biāo)曲方程為：y = 7.63x - 0.35，R2= 0.999 (圖 3-1)；D-半乳糖醛酸的標(biāo)曲方程為：y = 7.04x - 0.04，R2= 0.994 (圖 3-2)。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.672

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本文編號(hào)：2709948