【摘要】：蜂王漿是由工蜂下咽和下領(lǐng)腺體分泌產(chǎn)生的一種濃稠的乳白色液體。具有許多藥理學活性,如抗菌、抗腫瘤、抗過敏、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。蜂王漿中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要成分是蛋白質(zhì),特別是蜂王漿主蛋白3(MRJP3)和蜂王漿主蛋白1(MRJP1)。近些年研究發(fā)現(xiàn)糖鏈可能參與免疫反應,故蜂王漿N-糖鏈的表征對其免疫調(diào)節(jié)的研究具有重要意義。本文以蜂王漿糖蛋白為研究對象,研究蜂王漿N-糖鏈的類型和結(jié)構(gòu),并對糖鏈與免疫活性的關(guān)系進行研究,為蜂王漿免疫反應的研究提供一定的參考。主要研究結(jié)果如下:本文采用超速離心法對蜂王漿進行超速分離,得到上層溶液、中層溶液和下層沉淀,將不同組分蜂王漿凍干得到上、中和下層蜂王漿凍干粉。對上、中和下層凍干粉進行基本成分分析,發(fā)現(xiàn)下層沉淀中蛋白含量為57.44%,總糖含量為12.8%,10-HDA的含量為8.9%。經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)下層蜂王漿的主要蛋白是MRJP1,分子量約為55kDa。并對上層溶液、中層和下層中的四條蛋白條帶進行LC-MS鑒定,得上層溶液中的49kDa蛋白為蜂王漿主蛋白2(MRJP2)、60-70 kDa的蛋白條帶為MRJP3,下層蜂王漿中的55 kDa蛋白為MRJP1。蜂王漿主蛋白中N-糖鏈的類型及結(jié)構(gòu)研究。利陽肽-F糖苷酶(PNGaseF)將蜂王漿主蛋白1(MRJP1)的N-糖鏈釋放出來,并對糖鏈進行甲基化處理,采用ESI-MS對糖鏈進行結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明:下層蜂王漿中檢測到12條N-糖鏈,即6條高甘露糖型、4條雜合型和2條復合型糖鏈,其中一些糖鏈含有同分異構(gòu)體。蜂王漿主蛋白N-糖鏈對抗原免疫活性的影響研究。通過ProtScale和IEDB在線軟件對MRJP1的親水性、可塑性、β轉(zhuǎn)角和抗原線性表位進行預測。發(fā)現(xiàn)MRJP1的N-糖基化位點A28位于抗原表位區(qū)域,去糖基化蛋白可能對抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生影響。PNGaseF酶切除蜂王漿主蛋白中的N-糖鏈,采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來研究去糖基化對MRJP1免疫原性的影響,證實去糖基化蛋白(D-MRJP1)有效地降低了 MRJP1的IgG結(jié)合能力。并以MRJP1和去糖基化蛋白(D-MRJP1)為過敏原建立Balb/c小鼠免疫模型,對小鼠血清中MRJP1特異性IgE水平進行分析,發(fā)現(xiàn)去糖基化蛋白(D-MRJP1)免疫小鼠血清中特異性IgE水平顯著降低,證明MRJP1的N-糖鏈參與免疫反應。
【圖文】：

而Ｂ、Ｃ、Ｙ和Ｚ是由糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。下標數(shù)字表示裂解的位置，逡逑Ｘ、Ｙ和Ｚ離子的命名從還原端開始，而Ａ、Ｂ和Ｃ離子從非還原端開始命名，逡逑如圖１－２所示。逡逑戶邋＞邋ｙ＇邋Ｚ１邋：＞廣廣逡逑ＪＨｇ0Ｈ邋ｃ邐「＾邋ＣＨ２ＯＨ邋：逡逑圖１－２糖鏈碎片Ｄｏｍｏｎ－Ｃｏｓｔｅｌｌｏ命名法逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋Ｄｏｍｏｎ－Ｃｏｓｔｅｌｌｏ邋ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ邋ｆｏｒ邋ｇｌｙｃａｎ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ逡逑８逡逑

邐４４．３邋—邐、岤２逡逑■悘－，，眺逡逑圖２－１蜂王漿水溶液超速離心分離效果圖邋圖２－２蜂王漿超速分離后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｌｉｇａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邐Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ逡逑ｏｆ邋ａｑｕｅｏｕｓ邋ｒｏｙａｌ邋ｊｅｌｌｙ邐ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｏｙａｌ邋ｊｅｌｌｙ逡逑注：圖２－１中ＵＭＲＪＰｓ表示超速離心后的上層蜂王漿主蛋白、ＭＭＲＪＰｓ表示超速離心后的逡逑中層蜂王漿主蛋白、ＬＭＲＪＰｓ表示超速離心后的下層蜂王漿主蛋白；逡逑圖２－２中１：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋２：超速離心上層蜂王團蛋白、３：超速離心中層蜂王裝蛋白、４：超速逡逑離心下層蜂王漿蛋白、５：超速離心下層蜂王漿蛋白。逡逑２．３．２蜂王漿蛋白含量的結(jié)果分析逡逑ＢＣＡ法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ，二奎啉甲酸法）的測定方法是在堿性條件下，逡逑蛋白將Ｃｕ２＋還原為Ｃｕ＋，Ｃｕ＋與ＢＣＡ試劑形成絡合物并在５６２邋ｎｍ處的吸收值最逡逑大，吸光值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可根據(jù)吸收值測定蛋白濃度。該方法靈敏度逡逑高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定，不宜被干擾。逡逑以蛋白濃度為橫坐標，５６２邋ｎｍ處的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線如圖２－３逡逑所示，標準曲線方程為ｙ＝０．００９３ｘ＋０．０３７２，邋Ｒ２＝０．９９６９，將蛋白樣品的吸光值代入逡逑標準曲線方程，得蛋白濃度（ｍｇ／ｍＬ）。將凍干的蜂王漿粉配成３０ｍｇ／ｍＬ的溶逡逑液
【學位授予單位】：浙江工商大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S896.3

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本文編號：2709089