【摘要】：粉紅單端孢(Trichothecium roseum)引起的粉霉病是我國厚皮甜瓜的主要采后病害,硅酸鈉是植物的無機(jī)誘抗劑。我們之前發(fā)現(xiàn),果實(shí)防御T.roseum侵染以及硅誘導(dǎo)的果實(shí)抗性與能量代謝和活性氧密切相關(guān),但詳細(xì)機(jī)理不明。本文以采后“玉金香”厚皮甜瓜為試材,在分離純化果實(shí)線粒體的基礎(chǔ)上,研究T.roseum侵染和硅酸鈉處理對(duì)果實(shí)能量代謝以及活性氧積累的影響,分析T.roseum侵染和硅酸鈉處理后果實(shí)線粒體蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果表明:1.通過兩次Percoll密度梯度差速離心技術(shù)建立了厚皮甜瓜果實(shí)線粒體的分離純化方法,獲得的線粒體結(jié)構(gòu)完整,活性良好。經(jīng)多種蛋白提取方法比較,最終確定了酚抽提法為甜瓜線粒體蛋白的最優(yōu)提取辦法。2.T.roseum接種可誘導(dǎo)果實(shí)早期防御響應(yīng)中H_2O_2的顯著積累。通過活性氧熒光染色以及激光共聚焦掃描雙染定位發(fā)現(xiàn),接種誘導(dǎo)了果實(shí)氧爆,共定位結(jié)果證實(shí),活性氧主要來源于線粒體。果實(shí)接種后線粒體中與能量代謝的關(guān)鍵酶,H~+-ATPase、Ca~(2+)-ATPase、琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶酶活均被顯著調(diào)控。其中,接種后6小時(shí)H~+-ATPase、Ca~(2+)-ATPase、琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶活性均不同程度被抑制,而接種后12小時(shí)H~+-ATPase、Ca~(2+)-ATPase活性以及胞內(nèi)ATP含量均顯著增加。3.通過TMT技術(shù)分析接種T.roseum后12小時(shí)果實(shí)線粒體蛋白的表達(dá)情況,共獲到1613個(gè)定性定量蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,42種蛋白差異表達(dá),其中26個(gè)蛋白上調(diào),16個(gè)蛋白下調(diào),這些蛋白主要涉及能量代謝、脅迫響應(yīng)和氧化還原平衡、糖酵解和三羧酸循環(huán)、轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體穩(wěn)態(tài)等相關(guān)功能。4.采后100mM硅酸鈉浸泡可以顯著抑制損傷接種T.roseum果實(shí)的病斑擴(kuò)展。硅處理激活了接種果實(shí)的防御抗性,處理組織O_2~(-.)產(chǎn)生速率和H_2O_2含量快速升高。激光共聚焦熒光染色共定位證實(shí)這些活性氧主要來源于線粒體。此外,硅處理顯著提高了接種果實(shí)能量代謝關(guān)鍵酶,包括H~+-ATP酶、琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶的活性,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ATP的積累,并使之維持在較高水平。5.線粒體蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明,硅處理誘導(dǎo)結(jié)合病原物接種后甜瓜果實(shí)的蛋白差異表達(dá)情況,共獲得定性定量蛋白1694個(gè)。經(jīng)過生物信息學(xué)分析,51種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)均定位于線粒體。蛋白功能主要涉及初級(jí)代謝,蛋白功能包括呼吸電子傳遞鏈,三羧酸循環(huán),糖酵解途徑,氧化還原過程,防御和脅迫響應(yīng),線粒體載體,蛋白和氨基酸代謝等。綜上所述,厚皮甜瓜果實(shí)對(duì)T.roseum侵染具有積極的早期防衛(wèi)響應(yīng)能力,通過調(diào)控線粒體活性氧積累和能量代謝關(guān)鍵酶活性,提高并維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平,可更好地促進(jìn)細(xì)胞建立防御反應(yīng)和傳導(dǎo)脅迫信號(hào),抑制病原物的擴(kuò)展。此外,硅酸鈉作為一種安全有效的誘抗劑,可激發(fā)果實(shí)線粒體以更加充沛、快速和持久的方式調(diào)動(dòng)能量和活性氧代謝參與對(duì)病原物侵染的防衛(wèi)。
【圖文】：

物質(zhì)”并激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)，這種防衛(wèi)反應(yīng)的特征是具有對(duì)“非己物質(zhì)的排斥和阻止病原侵染的能力；植物對(duì)病原微生物的識(shí)別所激發(fā)的抗病基因介導(dǎo)的特異性識(shí)別，以及細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的廣譜性識(shí)別杰 等，2017）。Dodd and Rathjen（2010）在前人研究的基礎(chǔ)上，提免疫系統(tǒng)的概念。第一類植物免疫系統(tǒng)，又稱為基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)（圖物相關(guān)分子模式激發(fā)免疫系統(tǒng) （PAMP-triggered immunity, PTI）。P感受病原微生物的病原相關(guān)模式分子，從而激發(fā)出的免疫反應(yīng)。植胞質(zhì)膜上的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRR）感知物的病原相關(guān)模式分子，有諸如胞外空間病原菌釋放的鞭毛蛋白（或幾丁質(zhì)（真菌）等。圖中，藍(lán)色標(biāo)示的是植物細(xì)胞質(zhì)膜上的 PRR，結(jié)構(gòu)域中富含亮氨酸重復(fù)序列，紅色部分標(biāo)示的則是胞內(nèi)激酶結(jié)PTI 的信號(hào)途徑需要模式識(shí)別受體與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用，相關(guān)蛋甾醇敏感 1 型相關(guān)激酶 1（Brassinosteroid insensitive 1-associated ki1）。

圖 1.2 底火效應(yīng)的三個(gè)階段描述圖Fig. 1.2 The three states in priming (Balmer et al., 2015).底火效應(yīng)可以通過多種因素受到誘導(dǎo)，如化合物激發(fā)子（β-氨基丁酸、SA、哌啶酸、JA 以及部分揮發(fā)性有機(jī)化合物）、病原菌、草食性昆蟲或環(huán)境影響（Conrathet al., 2015）。植物防御也可以藉由有益土壤微生物，如根際細(xì)菌和根際真菌引發(fā)底火效應(yīng)（Pieterse et al., 2014）。根據(jù)不同的底火刺激物和脅迫，底火機(jī)制可以引發(fā)不同的機(jī)制（Balmer et al., 2015）。然而，除了底火誘導(dǎo)和刺激引發(fā)的特征外，底火效應(yīng)還具有一些關(guān)鍵特點(diǎn)。記憶性：當(dāng)一個(gè)植物處于待擊發(fā)狀態(tài)，刺激底火現(xiàn)象的信息被存儲(chǔ)，直到接觸刺激物觸發(fā)底火，這種效應(yīng)為植物防御的記憶性（Kandel et al., 2014）。擬南芥中一些分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)有利于檢測(cè)底火狀態(tài)。他們包括模式識(shí)別受體水平升高（例如，F(xiàn)LS2 和 CERK1），絲裂原活化蛋白激酶 MPK3 和 MPK6 積累增加，，轉(zhuǎn)錄因子（WRKYs and MYC2）增強(qiáng)表達(dá)、組蛋白修飾、DNA 低甲基化（Conrath et al.,
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.5

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本文編號(hào)：2704207