【摘要】：作為一種新的外來入侵有害生物,黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫蘆科(Cucurbitaceae)作物的重要病毒之一,由其引起的瓜類作物病毒病在生產(chǎn)中發(fā)生和危害日趨嚴重。該病毒病已對我國多個省市的葫蘆科作物生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失,目前尚無針對該病毒病的抗病品種和高效的山間病害防治方法。本論文以CGMMV-黃瓜、CGMMV-本生煙互作的病害系統(tǒng)為研究對象,開展以下3個方面的研究:1)篩選CGMMV脅迫下黃瓜中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因,為miRNA表達特性分析提供可靠依據(jù)。2)挖掘參與黃瓜-CGMMV互作過程的miRNA及其靶基因,分析其表達特性,探究響應CGMMV侵染的黃瓜miRNA的功能和調(diào)控網(wǎng)絡,為篩選黃瓜抗病基因提供新視角。3)通過人工miRNA技術特異性沉默CGMMV的功能基因,獲得抗CGMMV的轉(zhuǎn)基因本生煙(Nicotianabenthamiana)植株,為培育抗病品種提供新思路。主要研究結(jié)果如下:1)CGMMV脅迫下黃瓜miRNA定量表達中內(nèi)參基因的篩選。采用RT-qPCR方法對Actin、Tubulin、EF-1α、18SrRNA、Ubiquitin、GAPDH和 Cyclophilin 共 7 個內(nèi)參基因在 CGMMV 侵染的黃瓜植株葉、莖和根中的表達水平進行了檢測。使用delta-Ct、geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在線工具RefFinder等對內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行了分析和評價,并在miR159等多個黃瓜miRNA上驗證了上述內(nèi)參基閃的表達穩(wěn)定性。結(jié)果表明:EF-1α在黃瓜葉片和根中是最穩(wěn)定的可用于標準化miRNA表達的內(nèi)參基因,在系組織中,GAPDH表達最為穩(wěn)定,而Ubiquitin和EF-1α則是最適合所有類型樣品的內(nèi)參基因組合。2)響應CGMMV侵染的黃瓜miRNA功能分析。通過降解組測序和生物信息學分析,獲得了響應CGMMV侵染的47個黃瓜miRNA家族和3046個靶標轉(zhuǎn)錄本信息。采用實時定量PCR、Northern blot和5'-RLM-RACE等方法,對參與植物-病原物互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導等生物過程的部分黃瓜miRNA及其靶基因的表達特性、剪切位點等進行分析和驗證,結(jié)果表明:10個黃瓜miRNA及其調(diào)控的11個靶基因的表達水平在CGMMV接種后12 h～15 d的葉片樣品中發(fā)生了不同程度的差異表達,其中miRl 72與其靶基因XM011656616.1、miR3 93與其靶基因NM001280617.1以及miR858與其靶基因XM004140251.2等的表達呈負相關關系;miRNA與其靶標mRNA的剪切作用發(fā)生在miRNA成熟序列5'端開始的第10位核苷酸處。此外,構(gòu)建了 miRNA-靶基因-下游生物過程之間緊密聯(lián)系的調(diào)控網(wǎng)絡,其中黃瓜miR159靶向應對生物和非生物脅迫的正調(diào)控因子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PBS,csa-miRn6-3p可調(diào)控鈣依賴蛋白激酶CPK32,進而參與植物抗病反應。3)人工miRNA介導的病毒抗性評價。構(gòu)建了分別靶向CGMMV外殼蛋白(coat protein,CP)、移動蛋白(movement protein,MP)和復制酶(replicase,Rep)基因保守序列的6個人工miRNA表達載體,采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得過表達人工miRNA的轉(zhuǎn)基因本生煙植株。結(jié)果顯示,表達高水平的amiR1-CP、amiR4-MP和amiR6-Rep的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出一定程度的病毒“抗性”或“耐受性”,可減少病毒復制,降低發(fā)病率。表達低水平的amiR2-CP的轉(zhuǎn)基因植株,或表達中等水平的amiR3-MP和amiR5-Rep的轉(zhuǎn)基因植株則易受到CGMMV侵染的影響,并表現(xiàn)出花葉、斑駁等病毒病的癥狀。綜合分析得出,靶向CGMMV CP基因的人工miRNA介導的抗性水平最高。上述結(jié)果證明了應用人工miRNA介導的基因沉默技術有助于保護植物免受病毒病的危害。
【圖文】：

２００９）。逡逑１．２．３植物ｍｉＲＮＡ的作用機制逡逑如圖１－７所示，植物ｍｉＲＮＡ主要通過兩種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Ｐｏｓｔ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ邋ｇｅｎｅ逡逑ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）方式調(diào)控下游基因表達，即剪切與其序列反向互補的靶標ｍＲＮＡ或抑制靶標逡逑ｍＲＮＡ的翻譯（Ｌｉｕ扣ａ／．，邋２０１７）。一方面，當植物ｍｉＲＮＡ與靶標ｍＲＮＡ的序列完全或幾乎完逡逑全互補（僅０￣５個錯配堿基）時，ｍｉＲＮＡ在ＲＩＳＣ、ＨＡＳＴＹ等的作用下剪切下游靶標ｍＲＮＡ逡逑從而將其降解。Ｌｌａｖｅ等（２００２）采用５＇－ＲＡＣＥ實驗技術檢測切割后的ｍＲＮＡ片段，證實了逡逑ｍｉＲＮＡ可在其序列的第１０？１１位之間對反向互補的耙標ｍＲＮＡ序列進行特異性切割。另一方逡逑面，當植物ｍｉＲＮＡ與祀標ｍＲＮＡ的序列不完全互補時，ｍｉＲＮＡ則通過抑制耙標ｍＲＮＡ翻譯逡逑進行下游基因的表達調(diào)控。除上述兩種主要的作用機制外，植物ｍｉＲＮＡ對其靶基因的第三種逡逑作用機制是基于ＤＮＡ和組蛋白的甲基化，從而在轉(zhuǎn)錄水平對其進行調(diào)控，進而引起靶基因的逡逑轉(zhuǎn)錄后沉默（Ｋｈｒａｉｗｅｓｈｅｆａ／．

中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文邐第一章引言逡逑個重要方向和熱點。越來越多的研究揭示出ｍｉＲＮＡ在植物病害發(fā)生、發(fā)展中處于重要位置，逡逑很多研究課題或多或少都會涉及ｍｉＲＮＡ領域，而了解ｍｉＲＮＡ基本研究思路及方法是研究中不逡逑可缺少的重要步驟。逡逑ｍＲＮＡ邋－邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S436.421

【參考文獻】

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本文編號：2703327