【摘要】：作為一種新的外來(lái)入侵有害生物,黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫蘆科(Cucurbitaceae)作物的重要病毒之一,由其引起的瓜類作物病毒病在生產(chǎn)中發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重。該病毒病已對(duì)我國(guó)多個(gè)省市的葫蘆科作物生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,目前尚無(wú)針對(duì)該病毒病的抗病品種和高效的山間病害防治方法。本論文以CGMMV-黃瓜、CGMMV-本生煙互作的病害系統(tǒng)為研究對(duì)象,開(kāi)展以下3個(gè)方面的研究:1)篩選CGMMV脅迫下黃瓜中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,為miRNA表達(dá)特性分析提供可靠依據(jù)。2)挖掘參與黃瓜-CGMMV互作過(guò)程的miRNA及其靶基因,分析其表達(dá)特性,探究響應(yīng)CGMMV侵染的黃瓜miRNA的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為篩選黃瓜抗病基因提供新視角。3)通過(guò)人工miRNA技術(shù)特異性沉默CGMMV的功能基因,獲得抗CGMMV的轉(zhuǎn)基因本生煙(Nicotianabenthamiana)植株,為培育抗病品種提供新思路。主要研究結(jié)果如下:1)CGMMV脅迫下黃瓜miRNA定量表達(dá)中內(nèi)參基因的篩選。采用RT-qPCR方法對(duì)Actin、Tubulin、EF-1α、18SrRNA、Ubiquitin、GAPDH和 Cyclophilin 共 7 個(gè)內(nèi)參基因在 CGMMV 侵染的黃瓜植株葉、莖和根中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。使用delta-Ct、geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在線工具RefFinder等對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià),并在miR159等多個(gè)黃瓜miRNA上驗(yàn)證了上述內(nèi)參基閃的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明:EF-1α在黃瓜葉片和根中是最穩(wěn)定的可用于標(biāo)準(zhǔn)化miRNA表達(dá)的內(nèi)參基因,在系組織中,GAPDH表達(dá)最為穩(wěn)定,而Ubiquitin和EF-1α則是最適合所有類型樣品的內(nèi)參基因組合。2)響應(yīng)CGMMV侵染的黃瓜miRNA功能分析。通過(guò)降解組測(cè)序和生物信息學(xué)分析,獲得了響應(yīng)CGMMV侵染的47個(gè)黃瓜miRNA家族和3046個(gè)靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本信息。采用實(shí)時(shí)定量PCR、Northern blot和5'-RLM-RACE等方法,對(duì)參與植物-病原物互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程的部分黃瓜miRNA及其靶基因的表達(dá)特性、剪切位點(diǎn)等進(jìn)行分析和驗(yàn)證,結(jié)果表明:10個(gè)黃瓜miRNA及其調(diào)控的11個(gè)靶基因的表達(dá)水平在CGMMV接種后12 h～15 d的葉片樣品中發(fā)生了不同程度的差異表達(dá),其中miRl 72與其靶基因XM011656616.1、miR3 93與其靶基因NM001280617.1以及miR858與其靶基因XM004140251.2等的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;miRNA與其靶標(biāo)mRNA的剪切作用發(fā)生在miRNA成熟序列5'端開(kāi)始的第10位核苷酸處。此外,構(gòu)建了 miRNA-靶基因-下游生物過(guò)程之間緊密聯(lián)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中黃瓜miR159靶向應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的正調(diào)控因子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PBS,csa-miRn6-3p可調(diào)控鈣依賴蛋白激酶CPK32,進(jìn)而參與植物抗病反應(yīng)。3)人工miRNA介導(dǎo)的病毒抗性評(píng)價(jià)。構(gòu)建了分別靶向CGMMV外殼蛋白(coat protein,CP)、移動(dòng)蛋白(movement protein,MP)和復(fù)制酶(replicase,Rep)基因保守序列的6個(gè)人工miRNA表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得過(guò)表達(dá)人工miRNA的轉(zhuǎn)基因本生煙植株。結(jié)果顯示,表達(dá)高水平的amiR1-CP、amiR4-MP和amiR6-Rep的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出一定程度的病毒“抗性”或“耐受性”,可減少病毒復(fù)制,降低發(fā)病率。表達(dá)低水平的amiR2-CP的轉(zhuǎn)基因植株,或表達(dá)中等水平的amiR3-MP和amiR5-Rep的轉(zhuǎn)基因植株則易受到CGMMV侵染的影響,并表現(xiàn)出花葉、斑駁等病毒病的癥狀。綜合分析得出,靶向CGMMV CP基因的人工miRNA介導(dǎo)的抗性水平最高。上述結(jié)果證明了應(yīng)用人工miRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)有助于保護(hù)植物免受病毒病的危害。
【圖文】：

２００９）。逡逑１．２．３植物ｍｉＲＮＡ的作用機(jī)制逡逑如圖１－７所示，植物ｍｉＲＮＡ主要通過(guò)兩種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Ｐｏｓｔ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ邋ｇｅｎｅ逡逑ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）方式調(diào)控下游基因表達(dá)，即剪切與其序列反向互補(bǔ)的靶標(biāo)ｍＲＮＡ或抑制靶標(biāo)逡逑ｍＲＮＡ的翻譯（Ｌｉｕ扣ａ／．，邋２０１７）。一方面，當(dāng)植物ｍｉＲＮＡ與靶標(biāo)ｍＲＮＡ的序列完全或幾乎完逡逑全互補(bǔ)（僅０￣５個(gè)錯(cuò)配堿基）時(shí)，ｍｉＲＮＡ在ＲＩＳＣ、ＨＡＳＴＹ等的作用下剪切下游靶標(biāo)ｍＲＮＡ逡逑從而將其降解。Ｌｌａｖｅ等（２００２）采用５＇－ＲＡＣＥ實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)切割后的ｍＲＮＡ片段，證實(shí)了逡逑ｍｉＲＮＡ可在其序列的第１０？１１位之間對(duì)反向互補(bǔ)的耙標(biāo)ｍＲＮＡ序列進(jìn)行特異性切割。另一方逡逑面，當(dāng)植物ｍｉＲＮＡ與祀標(biāo)ｍＲＮＡ的序列不完全互補(bǔ)時(shí)，ｍｉＲＮＡ則通過(guò)抑制耙標(biāo)ｍＲＮＡ翻譯逡逑進(jìn)行下游基因的表達(dá)調(diào)控。除上述兩種主要的作用機(jī)制外，植物ｍｉＲＮＡ對(duì)其靶基因的第三種逡逑作用機(jī)制是基于ＤＮＡ和組蛋白的甲基化，從而在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而引起靶基因的逡逑轉(zhuǎn)錄后沉默（Ｋｈｒａｉｗｅｓｈｅｆａ／．

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章引言逡逑個(gè)重要方向和熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究揭示出ｍｉＲＮＡ在植物病害發(fā)生、發(fā)展中處于重要位置，逡逑很多研究課題或多或少都會(huì)涉及ｍｉＲＮＡ領(lǐng)域，而了解ｍｉＲＮＡ基本研究思路及方法是研究中不逡逑可缺少的重要步驟。逡逑ｍＲＮＡ邋－邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.421

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2703327