【摘要】：蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是一種廣泛侵染薔薇科果樹的RNA病毒,對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀具有嚴(yán)重影響。本研究首先利用高通量測序技術(shù)解析山楂屬植物中ACLSV的全基因組序列;然后對(duì)感染ACLSV的山楂植株和健康植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、小RNA組測序分析,明確ACLSV對(duì)山楂基因表達(dá)的影響,揭示源自ACLSV病毒小干擾RNA(vsiRNA)的組成和特性,預(yù)測山楂基因組中vsiRNA的潛在靶基因;最后通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證vsiRNA對(duì)山楂靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默作用及靶基因的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:1.通過高通量測序技術(shù)獲得了2個(gè)ACLSV山楂分離物SY02和SY03的基因組全長序列。利用RT-PCR方法對(duì)SY02序列進(jìn)行分段克隆驗(yàn)證,結(jié)果顯示分段克隆獲得的序列與轉(zhuǎn)錄組拼接序列的一致性達(dá)99.70%,表明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。將2個(gè)分離物序列上傳至NCBI,GenBank登錄號(hào)分別為KU870524和KU870525。將ACLSV山楂分離物與GenBank中其他15個(gè)ACLSV分離物的核酸及氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)ACLSV的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與它們寄主種類具有相關(guān)性。2.感染ACLSV和健康的山楂植株葉片的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,兩種材料之間有9910個(gè)基因差異表達(dá)(log_2 fold change≥1,padj0.01)。這些差異表達(dá)基因的KEGG功能聚類分析顯示,“植物病原菌互作”是上調(diào)差異表達(dá)基因富集最顯著的途徑,“類黃酮生物合成”是下調(diào)差異表達(dá)基因富集最顯著的途徑。3.小RNA組測序表明,感染ACLSV的材料中存在源自病毒的小干擾RNA(vsiRNA),其中21 nt長度的vsiRNA數(shù)量最多,占total vsiRNA的59.83%;正義鏈vsiRNA占總的vsiRNA的51.80~54.28%;5?端首位堿基偏好性C≈A≈UG;熱點(diǎn)區(qū)出現(xiàn)在復(fù)制相關(guān)蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶和解旋酶區(qū)域。4.對(duì)vsiRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測和功能注釋,發(fā)現(xiàn)源自ACLSV的vsiR1360(-)靶向了山楂基因CpLRR-RLK1。并通過qRT-PCR、RLM-5?RACE和煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)了vsiR1360(-)能夠沉默CpLRR-RLK1。5.從山楂中克隆出CpLRR-RLK1基因的全長序列,該基因CDS長度1794 bp,編碼597個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹分析顯示CpLRR-RLK1屬于LRR-RLK第II亞家族。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明CpLRR-RLK1定位于細(xì)胞膜。通過qRT-PCR技術(shù)分析了CpLRR-RLK1基因的時(shí)空表達(dá)特性,表明該基因在山楂成熟葉片中表達(dá)量最高,嫩葉中表達(dá)量最低�？寺×薈pLRR-RLK1基因的啟動(dòng)子并進(jìn)行了序列分析,結(jié)果顯示該基因啟動(dòng)子區(qū)域有很多防御和脅迫響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件。6.構(gòu)建了CpLRR-RLK1基因的過量表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了山楂CpLRR-RLK1基因在蘋果和擬南芥中的過量表達(dá)。獲得了4個(gè)擬南芥陽性過表達(dá)株系,8個(gè)蘋果過表達(dá)株系。山楂與蘋果LRR-RLK1基因相似性高達(dá)96.77%,以蘋果LRR-RLK1基因5?端特異性較強(qiáng)的395 bp序列作為RNAi干擾片段,構(gòu)建MdLRR-RLK1基因的沉默載體并轉(zhuǎn)化蘋果,獲得了17個(gè)沉默株系。7.對(duì)WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥接種Pst DC3000,由表型和胼胝質(zhì)及ROS的測定結(jié)果,判斷CpLRR-RLK1能夠介導(dǎo)擬南芥對(duì)細(xì)菌的防御性;通過對(duì)?GL-3?對(duì)照和轉(zhuǎn)基因蘋果接種斑點(diǎn)落葉病菌和炭疽葉枯病菌,過表達(dá)株系的發(fā)病率和病情指數(shù)比對(duì)照低,沉默比對(duì)照高,表明CpLRR-RLK1對(duì)真菌的抗病性;將宿有ACLSV和ASGV的蘋果試材與轉(zhuǎn)基因蘋果材料及對(duì)照?GL-3?進(jìn)行試管苗微嫁接試驗(yàn),病毒定性和定量檢測都表明CpLRR-RLK1基因?qū)CLSV和ASGV具有一定的抑制作用。
【圖文】：

病毒的檢測效率，擴(kuò)大了病毒檢測范圍，為果樹病毒病的研究霓等（1999）通過雙鏈 RNA（dsRNA）技術(shù)、RT-PCR 技術(shù)、隱病毒的生物學(xué)及生化特性。侯義龍等（2001）的研究指出 R靈敏度是傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法 PAS-ELISA 技術(shù)的 8000 倍。葉斑病毒的病原性質(zhì)及危害葉斑病毒是對(duì)果樹危害最大的一類潛隱性病毒，屬乙型線dae）纖毛病毒屬（Trichovirus），并已知感染多種薔薇科樹種（MV 是一種正義的單鏈 RNA 病毒，長度大約在 640-760nm，由組成。病毒的 5 端有帽子結(jié)構(gòu)，3 末端有 Poly(A)尾巴，5 和 包含 3 個(gè)相互重疊的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）Replication-associated protein，Rep），運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement proat protein，CP）三個(gè)蛋白（German et al., 1990; Sato et al., 1993CLSV 編碼的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，序列相對(duì)保守，但其 N 端與 MP 變區(qū)，因此 CP 基因序列是ACLSV 株系劃分的重要依據(jù)（鄭銀英

S（effector-triggered susceptibility）。這便引發(fā)宿主植物產(chǎn)生針Resistance gene，R gene）編碼的抗性蛋白（R 蛋白）來識(shí)別病效應(yīng)因子（Wu et al., 2003）。這種由效應(yīng)物促發(fā)的免疫叫效應(yīng)s-triggered immunity，ETI），屬于植物的第 2 層防御系統(tǒng)（El引起植物的高敏應(yīng)答，導(dǎo)致侵染部位和周圍細(xì)胞的快速死亡或物中傳播�！盎�?qū)颉奔僬f描述了植物的第 2 層防御系統(tǒng)，抗病基因和與之相應(yīng)的病原物的無毒基因結(jié)合時(shí)才得以表現(xiàn)2000）的實(shí)驗(yàn)證明水稻稻瘟病效應(yīng)因子 Avr Pita 和抗性基因 Phashi 等（2002）的報(bào)道，擬南芥 RPP8/HRT 家族的 R 基因 RC性。Zhu 等（2017）的文章表明胞內(nèi)免疫受體 Sw-5b 可以識(shí)別MP 的 21 個(gè)保守氨基酸的病毒效應(yīng)基序進(jìn)而對(duì)該病毒產(chǎn)生抗性進(jìn)化過程中，病原菌也會(huì)突變或產(chǎn)生新的效應(yīng)因子來逃避或者病原物的侵染性，而植物也會(huì)進(jìn)化出新的 R 蛋白，再次激活基因?qū)虻南嗷プ饔弥写嬖谥环N競爭，同時(shí)也是一種平衡相互作用呈現(xiàn) Z 字形的“拉鋸戰(zhàn)”局面（Jones and Dangl, 2006）（
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.619

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本文編號(hào)：2701444