【摘要】：二點(diǎn)螟Chilo infuscatellus(Snellen)屬于鱗翅目螟蛾科,是為害甘蔗的主要害蟲(chóng)之一,在我國(guó)各主要蔗區(qū)為害普遍。選育抗性品種是最直接、經(jīng)濟(jì)有效的防御害蟲(chóng)的方法,但是,由于甘蔗抗蟲(chóng)種質(zhì)的缺乏,通過(guò)常規(guī)雜交手段難以培育出高效的抗螟蟲(chóng)甘蔗品種。本文在對(duì)不同生育期的二點(diǎn)螟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析的基礎(chǔ)上,對(duì)二點(diǎn)螟幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆、表達(dá)和功能分析,篩選出對(duì)二點(diǎn)螟生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著致死效果的靶標(biāo)基因及其dsRNA序列,利用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系將含有二點(diǎn)螟CiChi1基因dsRNA序列的RNAi植物表達(dá)載體導(dǎo)入甘蔗心葉組織,創(chuàng)制抗二點(diǎn)螟的甘蔗轉(zhuǎn)基因植株,擬為甘蔗螟害綜合治理開(kāi)辟一條新的途徑。本研究取得以下幾個(gè)方面研究結(jié)果:(1)選取不同發(fā)育階段的二點(diǎn)螟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得4424800002個(gè)核苷酸,被組裝成95921個(gè)unigene基因,平均組裝長(zhǎng)度為1542 bp,N50和N90分別為2591 bp和653 bp。對(duì)這些unigenes基因在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋,共有53815條unigenes可以被注釋到不同數(shù)據(jù)中,占56.1%,其中有47849、36605和19406條unigenes成功注釋于Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)和Nt數(shù)據(jù)庫(kù),分別占注釋unigenes總數(shù)的88.9%、68.0%和36.1%,此外,有36890條unigenes被成功注釋在55個(gè)GO條目中,占68.5%。(2)從二點(diǎn)螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出二點(diǎn)螟幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因,并成功克隆了三個(gè)二點(diǎn)螟幾丁質(zhì)酶基因(CiChi1、CiChi2和CiChi11)和一個(gè)幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域1(CiChid1)片段。對(duì)這些基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)具有不同時(shí)空表達(dá)模式。CiChi1在成蟲(chóng)最高表達(dá),而在6齡前都顯著低表達(dá);CiChi2則在6齡和成蟲(chóng)高表達(dá),5齡的表達(dá)量最低;CiChi11的表達(dá)量則是在成蟲(chóng)期時(shí)低表達(dá),3齡最高表達(dá);CiChid1在5齡高表達(dá),1-3齡低表達(dá)。而在不同組織部位中,CiChi11和CiChid1,是在中腸組織高表達(dá),而在頭部和表皮組織中低表達(dá);CiChi1和CiChi2則是在表皮組織中高表達(dá),而在頭部和中腸組織中表達(dá)量相對(duì)較低。(3)利用RNAi技術(shù)對(duì)二點(diǎn)螟CiChi1基因進(jìn)行功能分析,結(jié)果顯示注射二點(diǎn)螟CiChi1基因的dsRNA,影響了二點(diǎn)螟的生長(zhǎng)發(fā)育。與對(duì)照相比,注射7天后,存活的二點(diǎn)螟體內(nèi)CiChi1基因表達(dá)量下降了70-80%,幼蟲(chóng)的死亡率達(dá)62%。(4)將CiChi1片段的干擾序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)建到植物表達(dá)載體pUC18中,獲得pUC18-CiChi1載體,隨后,連同pTEM73載體(內(nèi)含抗草銨膦除草劑的Bar基因)質(zhì)粒利用基因槍轟擊法導(dǎo)入甘蔗心葉組織。以含有EGFP序列的載體為陰性對(duì)照。經(jīng)過(guò)18%草銨膦的噴施篩選和PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè),共鑒定出79株轉(zhuǎn)CiChi1基因和5株轉(zhuǎn)EGFP基因的甘蔗植株。定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)CiChi1基因植株均能表達(dá)干擾片段,但是不同轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量有所差異。
【圖文】：

特異性地下調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄本的豐度。RNAi 效應(yīng)的基本過(guò)程主要分為以下三步：首先，涉及到 dsRNA 被體內(nèi) RNaseⅢ家族 Dicer 酶降解成為 21-23個(gè)堿基的小干擾 RNA（siRNA）；然后，siRNA 在細(xì)胞內(nèi) RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈。繼而，由反義 siRNA 再與體內(nèi) 些如解旋、內(nèi)切等酶結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA-induced silencing complex，RISC)；最后， RISC 與外源基因表達(dá)的 mRNA 的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合。因 RISC 表現(xiàn)出核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割 mRNA，切割位點(diǎn)即是與 siRNA 中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂 mRNA 隨即降解，導(dǎo)致翻譯受阻，最終產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象[9, 10]。其中，Argonaute 蛋白是催化 RISC 的主要組成，利用 siRNA 作為模板進(jìn)行識(shí)別和降解互補(bǔ)的 mRNA，RNA 干擾特異性的消耗目的基因的轉(zhuǎn)錄本，達(dá)到抑制或沉默基因的表達(dá)。RNAi 具有功能性的元件可分為兩塊， 是在細(xì)胞內(nèi)的核心部件，包括 Dicer 酶，RNA 結(jié)合因子和 Argonaute 蛋白；另 部分是系統(tǒng)性的成分，其能夠增加 dsRNA 的信號(hào)傳導(dǎo)，，并且使其能夠快速傳遞到其他的組織中[6, 7]。RNAi 作用流程如圖 1-1 所示。

和電泳儀 美國(guó) Bio-Rad中國(guó) 上海凌儀酶標(biāo)儀 美國(guó) BioTek實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng) 美國(guó) ThermoA 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序構(gòu)建和 Illumina 測(cè)序均由北京諾禾致源科技股份EBNext Ultra RNA 文庫(kù)制備試劑盒 (Illona ) 構(gòu)建，RNA使用總量為1.5 μg。最終產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化步評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量在 Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)用 TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia) 上聚類(lèi)索引編碼的樣本。生成后的集群，再將檢驗(yàn)iseq 測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生相應(yīng)的配對(duì)末圖 2-1。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S435.661

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本文編號(hào)：2700478